1．切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃环境下作用30min。然后用0．01mol／L pH7．2 PBS洗2次，每次10min，用吸水纸吸去或吹干余留的液体。 sysqy.com
2。滴加间接荧光抗体(如兔抗人广球蛋白荧光抗体等)，同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗2次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。
对照染色：
①抗体对照，用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性；
②抗原对照，即类属抗原染色，亦应为阴性；
③阳性对照。
上述方法称双层法。另一种间接法称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中相应抗体结合，再用该抗原的荧光抗体重叠结合其上，间接地显示组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下。
(1)切片或涂片固定后置于染色湿盒内。
(2)滴加未标记的特异性抗原作用切片，于37℃环境下30min。
(3)缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。
(4)滴加特异性荧光抗体作用切片于37℃环境下30min。
(5)同步骤(3)。
(6)缓冲甘油封固，镜检。
间接法只需制备一种荧光抗体即可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体(如麻疹)的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染患者血清病原体抗体的试验。
