ELISA操作步骤复杂，操作不当将引起较大的误差。以下叙述各个步骤中的影响因素。
1.加样
加样器是一种比较精密的工具，其在长时间使用时会因机械磨损或者推动杆内附着血痂等原因造成加样不准，尤其是对于样本量较大的临床实验室，因此必须定期对加液器进行维护和校准。
每次加不同的标本时均需更换吸嘴，以免发生交叉污染。
加样时速度不可太快，避免将标本加在孔壁上部 ，并注意不要溅出或产生气泡，产生气泡可以减少标本与包被物的接触，降低试剂的敏感性。不要让吸头接触孔底部，以防破坏包被物，吸附血清内的蛋白，造成假阳性。
加样时还应当注意操作时差对结果的影响，操作时差是指加入标本、试剂及混匀时间的差异。操作时差在每个实验中都存在，尤其是手工操作，日常检测标本多达几百个，从加入第一个标本到最后一个标本，需几十分钟，加入试剂及混匀等均存在着前后的时间差异，使抗原抗体反应和酶促反应时间不一致，操作时差对竞争法检测的结果影响更大，在加酶结合物和底物时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。如果使用滴瓶除注意滴加的角度外还要注意滴加的速度，速度太快，容易出现重复滴加或者加在两孔之间，造成非特异性吸附。另外有些项目在检测前需要稀释以减低非特异性反应，但稀释的方式非常重要，如果采用手工稀释则容易因操作者个体差异而产生不一致的结果，尤其是吸光度处于临界值附近的标本，因此最佳的方式是采用振荡器混匀。 实验室前沿，了解实验室动态
2.温育
在 ELISA检测中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温 育(incubation)。温育常采用的温度有 43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的温育温度，也是大多数抗原抗体结合的最适反应温度。有实验表明，抗原抗体反应一般在37℃经1～2小时产物的生成可达顶峰。为加速反应，可在一定范围内提高反应的温度并在反应过程中连续振荡以增加抗原抗体接触的机会。抗原抗体反应在4℃反应更为彻底，形成的产物更多更稳定，但因所需时间太长，在ELISA检测中一般不予采用。
温育的方式有温箱法、微波辐射法、水浴法等，其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异（这种现象被称为“边缘效应”）。若用温箱温育则ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。采用这种温育方式的关键是必须保证湿盒内的温度达到反应的要求，可在反应前将湿盒预温至规定的温度，并用温度计监测反应过程。采用水浴时，将ELISA板置于水浴箱中，板底贴着水面。为避免蒸发，板上应加盖或用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。温育过程中，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。严谨的ELISA试剂盒一般都规定了明确的温育温度，若要求室温温育，则一般是指20～25℃。微波辐射法能缩短温育时间，但不能解决“边缘效应”，因而较少使用。
3.洗涤
洗涤是ELISA测定过程中决定实验成败的一个关键步骤。其目的是去除反应体系中与反应无关的成分、未结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。由于抗原和抗体的包被通常是在碱性条件下与固相的疏水键相互作用而被动吸附于其上的，因此必须注意非离子去垢剂的使用浓度，最常用的洗涤液是含0.05％吐温20的0.02mol/L， pH 为7.4的 PBS液，如果洗涤液中的吐温20超过 0.2％，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响实验的测定下限。
洗涤可采用洗板机或手工洗涤两种方式，手工洗板则分为浸泡式和流水冲洗式洗涤。无论洗板方式如何，在向板孔内注液时应当避免气泡残留孔内，否则会因洗涤液难以进入孔中而影响洗涤效果。在采用洗板机洗板时，一定要将板条平放于板架上，保证洗板机上的每个吸液针都能一致地插入板孔底部将洗液完全吸净，否则空白值将升高甚至出现“花板”现象（背景不干净），造成实验失败，尤其是当酶结合物非特异吸附而残留于板孔时。若采用手工洗板，则可在每次弃去板孔内液体后将反应板于布料上拍干，布料可在消毒洗涤后重复使用。
手工洗板一般为3～5次，使用洗板机洗板时，其所需次数可通过以下实验确定：选择8×12 HBsAg ELISA包被板条，在每孔中平行加入相同的一份弱阳性血清，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育，洗板机设置如下：第1次洗涤1排、第2次洗涤2排、第3次洗涤3排……直至8次洗涤8排，每次只洗涤1遍，其结果是第1排洗涤了8遍，第2排洗涤7遍……第8排洗涤1遍，加底物显色后，根据吸光度值不再改变的反应条的洗涤次数来确定最佳的洗板次数，例如第3排反应条吸光度值不再改变，则认为该项目最佳洗涤条件为6遍。另外有三方面必须注意：一是在使用洗板机洗板时，通常在上机前应先将反应液弃去并用流水快速冲洗1遍，避免因反应液对洗板机管道污染而造成的交叉污染和背景颜色加深，但对于粘性大的稀释液或反应液而言，则需直接上机洗涤，并增加洗板后清水冲洗管路的次数；二是对于两步法而言第一步洗涤次数不宜太多，否则将降低结果的吸光度值。 本文来自实验室前沿
4.显色
显色是 ELISA中的最后一步温育反应，在以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中，主要采用TMB和OPD两种底物，其中以TMB最为多见，TMB底物显色一般要求室温或37℃反应15～30分钟。研究表明，显色受时间和温度的影响，一般37℃反应30分钟可使显色充分，如果缩短反应时间或者降低反应温度均可影响检测的下限。为了保证结果的稳定性，必须固定显色时间和温度，但不少操作者往往忽略了这一点。TMB显色体系的A液和B液可在使用前先混合然后用排枪加入反应孔中，这样既节省人力又缩短了操作时差对结果的影响。反应液应新鲜配制并且避免接触金属器皿，否则可因氧化等原因产生颜色反应。OPD由于其具有致癌性目前已很少使用。
5.比色
ELISA显色的结果必须通过酶标仪进行检测，有两个重要的原因：一是不同的个体的色觉存在差异，如果仅凭肉眼判断，则结果重复性差，并且难以形成统一的判断标准，尤其是对于HBeAb、HBcAb这样的检测项目；二是日益频繁的医疗纠纷要求临床实验室必须对ELISA检测的原始吸光度值，阴阳性判断结果等原始数据进行保存，否则面对医疗纠纷时将无法举证。
TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止，各类酸性终止液则将蓝色转变成黄色。有实验表明，从终止反应后2分钟开始，样本的吸光度值逐渐下降，起始吸光度值越高其下降速度越快，为保证实验结果的稳定性，宜在终止反应后2分钟内读取吸光度值。 实验室前沿，了解实验室动态
酶标仪应采用双波长进行测定，必须包括对颜色产物敏感和不敏感的两个吸收峰波长，在非敏感波长处测定特异性显色的吸光度值接近为零，此时测的吸光度值为容器上的划痕、指印、背景等造成的光干扰。以TMB底物为例，其最大吸收的波长为450nm，非敏感波长为630nm，双波长检测最终得到的吸光度值为两者之差。双波长测定能去除背景的干扰，一般不设空白孔，否则会出现吸光度值为负值的现象。
酶标仪的使用需强调仪器的维护和保养，酶标仪首先应放置通风处，避免机器内部尤其是滤光片发霉，在使用过程中避免酸等物质溢出腐蚀仪器，每半年或一年请计量局对酶标仪进行检定，并请厂商定期维护。比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体。酶标仪在使用前应先预热15～30分钟，测读结果会更稳定。
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