保证免疫金标技术检验准确性】 sysqy.com
【本SOP适用范围】
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【该SOP变动程序】
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本标准操作程序的变动,可由任一使用本SOP的工作人员提出,并报经下述人员批准签字:专业主管、科主任。
【原理】
氯化金分子在还原剂作用下聚合形成金颗粒,颗粒与颗粒之间因静电作用而相互排斥,使其保持一个比较稳定的胶体状态,故称作胶体金。利用胶体金颗粒的高电子密度及其表面能结合生物大分子(如抗体、SPA、植物血凝素和刀豆蛋白A等)以 及具有一定颜色等特性,可用光镜和电镜对细胞内抗原进行定位、定性的研究。
【方法学分类】
1. 班点金免疫渗滤试验 固相膜免疫测定中液体在微孔膜中穿过流出呈穿流形式,为斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay,DIGFA),亦有称免疫金溶胶斑点法、滴金免疫测定法等。试验单位为三层反应盒,第一层为过滤器(滤纸层),第二层为反应膜(NC膜或MC膜)上点加有特异性抗原或抗体,第三层为吸水垫料,有称此渗滤装置为滴金反应板。
以双抗体夹心法测dsDNA为例:试验中将标本加在反应盒上,血清(标本)透过过滤层进入反应层,反应层上点有“一”字形抗IgG(或某种人血清蛋白作为试验阳性对照)及“.”形被测物相应抗体,血清中抗原与反应层中抗体结合,其余无关蛋白等滤出膜片,加入金标记抗体试剂,反应膜上“一”字形及“.”形均显红色为试验阳性,仅“一”形显红色为试验阴性(试剂盒状态良好),“一”不显色提示试剂盒质量不合格,需另取反应盒重做试验。
试剂盒基本试剂成分有滴金反应板、金标记试剂及洗涤液。
2. 斑点金免疫层析试验 固相膜免疫测定中液体通过毛细管作用在膜上向前移行呈横流形式,为斑点金免疫层析试验(dotimmunogoldchromatographyassay,DIGCA)。试验单位为一滤膜条,自上而下分有多个层次。
如单克隆双抗体法测HCG,滤膜条各区域分别为:吸水滤纸—固定有金标二抗的MC膜—固定有抗β-HCG抗体的MC膜—金标记抗。α-HCG玻璃纤维—吸尿玻璃纤维。试验中将滤膜条浸入被测尿液或滴加尿液,尿液在毛细管作用下向试纸条上端缓缓移行,尿液将金标抗。α-HCG溶解并带动它向前移动,结合尿中HCG至抗β-HCG抗体处形成复合物,并在抗β-HCG抗体固定处显示胶体金特有红色,提示试验阳性。尿中无HCG时,溶解的抗α-HCG至固定有金标二抗的MC膜处显示胶体金特有红色(质控线条),提示试验阴性。
试剂盒基本单位仅有一滤膜条,只有一步操作。
3. 胶体金颗粒的制备
在氯化金溶液中加入不同的还原剂,可制备出不同大小的金颗粒。常采用柠檬酸、抗坏血酸和白磷。用这三种还原剂可分别制备出大、中、小三种主要胶体金颗粒。目前,有更多的实验室仅以柠檬酸为还原剂,在柠檬酸还原氯化金时,加入不同量的单宁酸即可获得大小不同的金颗粒,所制备金颗粒的大小非常一致。
[1] 以抗坏血酸为还原剂制备10~15nm直径的胶体金(Au l5) 在一个洗净烤干的250 ml容量的三角烧瓶中,加入20ml三蒸去离子水(3DW)、l ml 0.1 mol/L K2CO3和l ml%氯化金水溶液于冰浴中混匀,立即加入l ml 0.7% 抗坏血酸,并充分摇动至溶液呈紫红色,加3DW至100ml,100℃水浴5min后,溶液变成红色,放室温冷却待用。
[2] 以柠檬酸为还原剂制备8~10 nm直径的胶体金(Au l0) 125 ml 3 DW煮沸后加入1% 柠檬酸7.5 ml,再煮沸5 min,迅速加入1.25 ml%氯化金溶液,100℃水浴15 min,溶液置室温待用。
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