有若干种方法常用于提高免疫印迹的灵敏度。一种是在电泳之前应用免疫沉淀法将抗原进行纯化和浓缩(见前)。该法可浓缩极低浓度的抗原，并可在电泳和免疫印迹之前将其与无关的蛋白质分离，使对极低浓度抗原的研究成为可能。提高检测灵敏度的其他方法都是针对增强信号本身强度设计的。其中包括使用信号更好和更强的荧光试剂或使条带局部酶的活性增强。一些公司不断地推出新的性能更好的化学发光检测系统，而使用者则继续注重于研制更好和更灵敏的试剂。
信号可通过使用三重检测系统而得到加强，例如，使一抗，二抗和三抗相继与抗原结合形成复合物。这必然使得结合物中标记抗体分子的数量增多。例如，假如有5个二抗分子可结合在一抗上，又有5个三抗分子可结合在二抗上，那么该系统就比仅用标记一抗所产生的信号增强25倍。
有多种方法可确证某一条带是所需的抗原：①与纯品进行比较，该样品在相邻泳道上形成单一条带；②使用能识别抗原不同表位或区域的多份抗体；③使用可被相应抗体定位的标记抗原；④或使用电泳迁移率改变的抗原(氨基端或羧基端)截短体。
1．准备工作
在准备做抗原检测时，须考虑所用一抗和二抗的最佳浓度，下面是一抗起始用量的参考；然而，对不同来源的抗体，其特异性抗体的浓度均不相同。因此，对抗体进行滴定有助于确定最佳信噪比。预先滴定二抗对实验也有帮助。一旦确定最佳浓度，则每次印迹即可用同一批二抗来完成。
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2．所需溶液和试剂
PBS；3％BSA／PBS；封闭液；一抗溶液；标记的二抗试剂(通常是用辣根过氧化物酶标记的抗免疫球蛋白抗体)；化学发光溶液；X射线片。
3．操作步骤
(1)用PBS漂洗印迹膜数次。
(2)加入一种封闭液。
不同的抗原和实验方法需用不同的封闭缓冲液。例如，BSA(V部分)和牛奶都含有磷酸化的酪氨酸和生物素。这给解释用特异性抗磷酸化酪氨酸抗体进行的实验造成一定的混淆，也给亲合素／链霉亲合素检测的应用带来一些问题。某些牛奶制品可抑制碱性磷酸酶的活性。若无信号或检测背景较高，则需检查不同的封闭缓冲液。
(3)室温下搅动孵育。一般孵育20min～2h较好。
若是用小的印迹膜条，每条可以放在1支试管中。最好是用顶部可封口的5ml试管。15ml×0．5cm的印迹膜条用0．5ml的试管即可。
(4)从封闭缓冲液中取出印迹膜，用PBS清洗2次，每次5rain。
(5)加入一抗溶液。每张15craXl5em的印迹膜用量为10m!。所有的稀释液均用含有蛋白质的溶液，例如3％BSA／PBS。孵育可在浅盘中进行。 copyright sysqy.com
使用组织培养上清可以不稀释或1：10稀释。得到的抗体浓度为1～50ug／m1。抗血清、腹水或纯化抗体的最终浓度也应在此范围内。一般将10ul稀释成10ml已足够。假如抗体的浓度尚未知，应试做若干稀释以确定最适范围。
(6)在室温下将抗体和印迹膜搅动孵育至少1h。有实验者报告孵育过夜(12—18h)可提高灵敏度。
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装在封口袋中的印迹膜(左)；放在容器中的印迹膜(右) sysqy.com
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完整印迹膜(左)与印迹膜条带(右)
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(7)用PBS清洗印迹膜4次，每次换液洗5min。
(8)此时，印迹膜便可加入标记的二抗。若检测完整的印迹膜，可在浅盘中孵育。抗体用含有蛋白质的溶液进行稀释，例如3％BSA／PBS。商品化的酶标二抗应在5—0．5ug／m1浓度之间使用(通常将商品试剂原液稀释成1：200～1：2000的应用液)。用辣根过氧化物酶标记的试剂需用不含叠氮钠的封闭液稀释。酶标A蛋白，抗免疫球蛋白抗体，亲合素和链霉亲合素等均有商品试剂。
(9)室温下搅动孵育1h。
(10)用PBS清洗印迹膜4次，每次换液洗5min。
(11)化学发光试剂需临用前配制。每次仅配置需用量，因其半衰期很短。目前较多使用专为化学发光提供的商品化试剂。一般是将2种溶液按1：1混合。其中一种溶液
含有过氧化氢，另一种溶液含有鲁米诺，也许还有化学增强剂。若不选厨商品化的试剂，有关这2种试剂的替代物在下文中可找到(附录Ⅲ)。
(12)将印迹膜孵育lmin。
(13)用纸巾吸去印迹膜边缘或边角部分多余的化学发光试剂。将印迹膜放入塑料袋中并确保干的表面与胶片接触。
(14)将印迹膜在暗室中使胶片曝光lmin。冲洗胶片以确定所测抗原的正确曝光时间。曝光时间可短至几秒钟也可长达数小时。
(8)此时，印迹膜便可加入标记的二抗。若检测完整的印迹膜，可在浅盘中孵育。抗体用含有蛋白质的溶液进行稀释，例如3％BSA／PBS。商品化的酶标二抗应在5—0．5ug／m1浓度之间使用(通常将商品试剂原液稀释成1：200～1：2000的应用液)。用辣根过氧化物酶标记的试剂需用不含叠氮钠的封闭液稀释。酶标A蛋白，抗免疫球蛋白抗体，亲合素和链霉亲合素等均有商品试剂。
(9)室温下搅动孵育1h。
(10)用PBS清洗印迹膜4次，每次换液洗5min。
(11)化学发光试剂需临用前配制。每次仅配置需用量，因其半衰期很短。目前较多使用专为化学发光提供的商品化试剂。一般是将2种溶液按1：1混合。其中一种溶液
含有过氧化氢，另一种溶液含有鲁米诺，也许还有化学增强剂。若不选厨商品化的试剂，有关这2种试剂的替代物在下文中可找到(附录Ⅲ)。
(12)将印迹膜孵育lmin。
(13)用纸巾吸去印迹膜边缘或边角部分多余的化学发光试剂。将印迹膜放入塑料袋中并确保干的表面与胶片接触。
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(14)将印迹膜在暗室中使胶片曝光lmin。冲洗胶片以确定所测抗原的正确曝光时间。曝光时间可短至几秒钟也可长达数小时。
