原位杂交组织化学标本制备
(一)取材
用于原位杂交反应的组织应尽可能新鲜，因此要求取材迅速。由于很多RNA极易降解，取下的组织应尽可能迅速固定或冷冻。为了避免外源性RNA酶引起靶组织中RNA丢失，取材时应戴手套，所用的器械、容器都要经高压消毒，或清洁后用经焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)处理过的灭菌蒸馏水清洗。此外，避免用手直接接触组织、器械、容器和溶液等。
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(二)固定
进行原位杂交时，组织常需要用化学固定剂进行固定。在固定剂的应用和选择上应兼顾三个方面，即保持良好的细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平和使探升易于进人细胞。DNA比较稳定，固定剂的种类和浓度并不十分重要，而RNA极易被降解。故在固定时，固定剂的种类、浓度和固定时间均十分重要。
1．固定剂 固定剂分为沉淀固定剂和交联固定剂两类。常用的沉淀固定剂有乙醇和丙酮等，交联固定剂有多聚甲醛和戊二醛等。经用沉淀固定剂固定的组织通透性较好，利于探针穿人组织，但沉淀固定剂可能引起RNA的丢失，而且保存组织形态结构也不十分理想。醛类交联固定剂可较好地保存组织中的RNA，对保存组织形态结构优于沉淀固定剂，但由强交联固定剂戊二醛固定后的组织通透性很低，探针较难进入其中。一般认为，4％多聚甲醛固定对检测mRNA的组织较为理想，它既能有效地保存靶RNA和组织形态结构，又可使组织具有一定通透性。
2．固定方法 固定方法可分浸渍法和灌注法。取材方便的组织，在迅速取材后立即浸入固定液中进行浸渍固定。而对较难取材的组织，先行灌注固定，然后取材，并将取下的组织浸入固定液中再行浸渍固定。固定后的组织浸入25％的蔗糖磷酸缓冲液中，置4℃冰箱过夜，次日冰冻切片或保存在液氮中待冰冻切片。经固定和漂洗后的组织也可在25％蔗糖磷酸缓冲液中于4℃保存1—2个月。新鲜组织也可在取材后直接以液氮或干冰速冻，冰冻切片后再浸人4％多聚甲醛固定10—30分钟，干燥后立即进行杂交或保存在-80℃冰箱内备用。
(三)切片
1．冰冻切片 在原位杂交中以冰冻切片最常用。切片时，要尽量避免RNA酶污染，操作时需戴手套，使用70％酒精擦洗工作台、切片机刀架、摇柄和载物台等手常接触的部位以及其他器械。切片厚度可根据具体情况而定。如靶组织中待测mRNA量较少，所采用的原位杂交方法敏感性较低，为了能得到较多的信号，切片可厚些(约15—20~m)，反之则可薄些(约5—10~m)。粘贴切片前，载玻片要清洗干净，使其不含RNA酶，并进行硅化处理。清洗方法：先用热肥皂水刷洗，自来水清洗干净后置于清洁液中浸泡24小时，清水洗净烘干，95％乙醇中浸泡24小时后蒸馏水冲洗，150~C以上高温烘干，锡箔纸包好无尘存放。硅
化载玻片的制作步骤如下：
(1)将清洗干净的载玻片在丙酮中浸泡5分钟进行脱脂；
(2)再人无水乙醇浸泡5分钟，然后风干；
(3)继之浸人硅烷(silane)液数秒(配法：将4ml 3—氨基—丙基三乙氧基硅与P00ml丙酮混合即可)；
(4)移至丙酮内5分钟；
(5)入双蒸水5分钟；
(6)最后风于备用。
由于原位杂交的实验周期长，实验程序繁杂，为了防止组织或细胞标本在杂交过程中脱落，载玻片要涂以铬矾明胶或多聚赖氨酸<分子量大于300 000)等黏附剂。
2．石蜡切片 石蜡切片展片时需用含DEPC的双蒸水加温展片，制成的石蜡切片置于52℃烤箱中过夜后即可进行原位杂交反应。经烤干的切片可在室温下保存。
3．培养细胞 培养细胞标本制备常采用细胞离心法。先将生长在培养瓶壁上的细胞用胰蛋白酶处理，制成每毫升含1×105细胞浓度的悬液，经离心制成细胞离心标本，使细胞贴附于经处理的载玻片上，经空气干燥1～2分钟后浸渍固定，再经PBS和蒸馏水漂洗后置37℃干燥保存或?0％乙醇4℃保存。如果细胞直接生长在载玻片或盖玻片上，则可将长有细胞的载玻片或盖玻片直接固定，再按上述方法漂洗、干燥和储存。
