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免疫亲和层析柱上洗脱抗原方法

时间:2010-10-17 01:09|来源:实验室前沿| | 分享|点击:


   实际上,从免疫亲和层析柱上洗脱抗原很快且较容易。大多数工作是花费在设计和用于摸索各种有效的洗脱条件。可以采用三种方法进行洗脱,以阻断抗原抗体之间的相互作用:①用较强烈的条件处理;②加入模拟结合位点的饱和量小分子化合物,和/或③使用一种能引起构象改变而使抗原释出的试剂。

内容来自dedecms

    最常用的洗脱方法是基于破坏抗体与抗原之间的结合键。洗脱的条件可以较为强烈,使抗体和抗原变性,或采用比较温和,使抗原和抗体仍保持原来活性。
    采用相对强烈的洗脱条件根据所用抗体而定。如果使用亲和纯化的多克隆抗体,抗原的洗脱条件可以和用于纯化抗体的条件相同。否则洗脱条件只能根据实验经验来确定。可以通过测试一系列缓冲液来建立洗脱条件。
    当所用的抗体是针对一种合成肽时,通过加入一种超过克分子量的合成肽,有时即可将抗原洗脱。当抗原抗体间的作用发生解离,过量的肽结合到柱上就抑制了抗原重新结合,因而被洗脱。尽管这种方法极富吸引力,包括温和的洗脱条件,但达到有效的洗脱常很困难。关键性的变化因素包括抗原抗体结合的解离率和抗体对肽与整个抗原的相对亲和力。因为抗体是针对肽而产生的,它们通常可有效地与肽结合,所以主要问题是解离率。就洗脱而言,最有效的方法是将多肽与抗原抗体柱接触直到建立新的平衡。借助高亲和力的作用,可以采取延长反应时间或加入过量的肽。为了测试洗脱条件,可将递增量的肽加至一支小层析柱内。将洗脱缓冲液流速调到尽量慢,以增加肽与层析柱的接触时间。如果肽本身不能充分有效洗脱,可将高浓度的肽与不同的洗脱缓冲液相结合,将小量试验得出的洗脱条件再扩大应用于大规模洗脱。
    第三种洗脱方法是根据用合适的配体处理抗原抗体柱引起变构,这种方法仅适用于某些蛋白。这些变构改变包括用ATP或小的辅助因子处理抗原而引起的构象改变。识别这些构象改变的抗体,或能与构象改变而解离的蛋白—蛋白复合物相结合的抗体可以用于制备各种纯的蛋白。由于这类洗脱方法因抗原不同而异,在此不作详细介绍。但可以提供一种有效的和独特的洗脱方法。
    1.准备工作
    此法最大的难点是确定恰当的洗脱条件。为了获得一个清晰的洗脱峰形和较纯的抗原,需要花费大量的时间进行试验和调整洗脱条件。
    2.所需溶液和特别设备
    预洗脱缓冲液;
    洗脱缓冲液;
    中和缓冲液;
    简便的层析装置;透析袋及相应的装置。
    如果是对蛋白层析很有经验者可采用分段增加洗脱条件而不采用逐步洗脱。
    3.操作步骤
    (1)用20倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱,以更换柱内的缓冲液。推荐的预洗脱缓冲液。
    (2)采用分段洗脱,连续以0.5倍柱床体积的洗脱缓冲液流经层析柱,用EP管分别收集各组分,如果洗脱液pH值偏高或偏低,收集管中需加入0.1柱床体积的中和缓冲液。
免疫亲和层析柱分部收集
    (3)测试每管抗原量,将含量高的各管合并,根据抗原的用途,可将获得的蛋白洗脱液透析去盐或改变缓冲液。
    (4)再用20倍柱床体积的起始缓冲液通过柱基质,使层析柱再生。加入0.01%硫柳汞,可以长期贮存(4℃)。
Tags:方法,亲和,免疫,抗原,抗体,条件,缓冲,结合,可以,采用,
责任编辑:何辉

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