器材和试剂的准备
TAE缓冲液:40 mm01/L Tris-乙酸,1 mm01/L乙二胺四乙酸(EDTA);调pH至8.0,高压灭菌
TAE/琼脂糖凝胶:TAE缓冲液,1%(w/v)琼脂糖,1:5000(体积比)10%溴化乙锭
2YT培养基:10g细菌用酵母提取物,16g细菌用胰蛋白,5g NaCl;加水到1L并用NaOH调pH到7.0,高压灭菌
2YT/carb/cmp培养基:2YT,50ug/m1羧苄青霉素,5ug/ml氯霉素
2YT/carb/尿嘧啶培养基:2YT,50ug/m1羧苄青霉素,0.25ug/m1尿嘧啶
磷酸盐缓冲液 (PBS): 137mmo1/L NaCl, 3mm01/L KCl, 8mm01/L Na2HP04, 1.5mm01/L KH2P04, 用HCl调pH到7.2,高压灭菌
聚乙二醇 (PEG)/NaCl溶液: 20%PEG 8000, 2.5 m01/LNaCl
QIAprep Spin M13试剂盒[Qiagen,QIAprep离心柱,缓冲液MP,含镁的裂解缓冲液(MLB),洗涤液PE,缓冲液EB]
M13K07辅助噬菌体
1.从一个新鲜的培养皿中挑取含有适当噬菌粒的大肠杆菌CJ236(或另外的dut-/ung- 型菌株),接种于1ml 2YT培养基,培养基中含有适当的抗生素以维持宿主的F’片段 和噬菌粒。例如,2YT/carb/cmp培养基含有羧苄青霉素(carbenicillin)可用来筛选 含有p-半乳糖苷酶基因(p-1actamase gene)的噬菌粒和氯霉素(chloramphenicl)可用来筛选CJ236的F’片段。37℃,200r/min培养6~8小时。加入M13K07辅助噬菌体至终浓度为每毫升1010个噬菌体{使得最终复合感染[multiplicity of infection(moi)]次数约为10次}。37℃,200r/min培养15分钟,转移培养基至30m1 2YT/ carb/uridine培养基中。37℃,200r/min培养过夜。
2.用SorvallSS-34转子(27000g)15000r/min 4℃离心10分钟。转移上清至一个新试管中, 加入l/5体积的PEG/Na口溶液并室温孵育5分钟。用SS-34转子(12000g)10000r/min 4℃离心10分钟,弃去上清。4000r/mln(2000g)短暂离心并吸掉剩余的上清。
3.用0.5mlPBS重悬噬菌体颗粒。用SS-34转子15000r/min 4℃离心5分钟以去除不溶 物质。转移上清至1.5m1微型离心管。
4.加7.0ul的MP缓冲液并混合,室温孵育至少2分钟。
5.将样品加入到置于2m1微量离心管中的QIAprep离心柱内,在微型离心机中8000r/min离心15秒。丢弃滤出液,噬菌体颗粒则吸附在柱基质上。
6.向柱子中加入0.7m1 MLB缓冲液。8000r/min离心15秒,丢弃滤过液。
7.另加0.7m1MLB缓冲液,室温孵育至少1分钟,8000r/min离心15秒。丢弃滤出液,DNA已和蛋白衣壳分离并仍然吸附于基质上。
8.加0.7ml洗涤缓冲液PE。8000r/min离心15秒,丢弃滤过液。
9.重复步骤8,除去残存的蛋白和盐。
10.8000r/min离心30秒,把QIAprep离心柱转移至未使用过的1.5m1微型离心管中。
11.加100/11EB缓冲液(10mmol/LTris-HCl,pH 8.5)到柱膜的中央。 室温孵育10分钟并以8000r/min离心30秒。保存洗脱液, 因为它含有纯化的dU-ssDNA。
12.通过在TAE/琼脂糖凝胶上电泳1.0ul分析DNA。该DNA应显示为主要是一个单条带,但具有较低电泳迁移率的模糊条带也经常可见(图2-2中的条带2)。这些可能由ssDNA的二级结构引起。通过测定260nm处的吸光度(33ng/ul ssDNA对应于A260=1.0)来测定DNA的浓度。典型的DNA浓度介于200-500ng/ul1之间。