一、杂交前准备
(一)DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。
DEPC即二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate),可灭活各种蛋白质,是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中,所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是:取市售DEPc 1ml,加入1L待处理水(蒸馏水等)中,经猛烈振摇后,于室温静止数小时,然后高压灭菌,以除去降解DEPC(DEPC分解为CO2和乙醇)。有些试剂可直接加入DEPC,终浓度一般为0.1%~0.4%,原则上在杂交及其以前的步骤中,所有液体试剂均需用DEPC处理,或用DEPC水配制,包括乙醇的稀释。此外,接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。
注意:DEPC是一种潜在的致癌物质,在操作中应尽量在通风的条件下进行,并避免接触皮肤。②含有Tris缓冲液的溶液中,不能加入DEPC。
(二)载玻片的处理
组织原位杂交,常在载玻片上进行,故载玻片的洗涤至关重要,必须保持清洁,并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下:
(1)先经洗衣粉浸泡过夜,次日自来水冲洗后,泡酸数小时以上,取出后再用流水冲洗,双蒸水冲洗2~3次,置160℃以上烤箱中烧烤4h以上,或经15磅高压灭菌20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。
(2)HCl处理法
(三)硅化
【方法1】(1)将一扎新的盖玻片散开,在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷却后,倒掉盐酸。
(2)用去离子水沉漂洗玻片,竖放在架子上自然干燥。
(3)硅化盖玻片:通风条件下,将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣(dimethyldichorsilane,DMDC)液中浸几下,竖入在架子上干燥。
(4)收集干燥的盖玻片于一可耐热的petri氏盘(或培养皿)中,用去离子水漂洗数次,彻底清洗。
(5)用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好,于180℃烘烤4h过夜。取出待冷至室温后,即可进行后续处理。
附:2%DMDC
配制:按比例两者充分混匀,静止待气泡消失即可使用。
用途:硅化玻片(载片、盖片均可)。
【方法2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中,并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时,在干燥器中放一盛有约1m二甲二氯硅浣(dimethyldiorosilane,DMDC)的小烧杯。盖好干燥器(确保密闭),抽真空约5min,然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架,用锡箔纸包埋,于250℃以上烘烤4h以上,最好过夜。冷却后备用。
本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60℃烧干。
【方法3】APES(氨丙基三乙氧基硅浣)法
【方法4】
(1)49ml氯仿与1mg二甲二氯硅浣(DMDC)配液;
(2)倒入每个拟硅化的试管或离心管中,浸泡5min后用乙醇或重蒸水冲洗;
(3)玻璃器皿使用前位于180℃以上烘烤2h以上,塑料器皿应于60℃烘烤过夜。
注意:DMDC有毒且高度挥发,应于通风环境操作并戴口罩、手套,避免接触皮肤或吸入。
(四)载片的包被(粘贴)
1.沾附剂
(1)多聚赖氨酸(poly-L-Lycine,PLL)
储备液(0~5%)
按上述剂量充分混合,即为浓度为5mg/ml(0.5%)的PLL液。常分装成1ml的包装,-20℃存放。该液为储备液,可反复冻融,无明显影响。用前充分混合。
工作液(0.01%):
充分混合,静止待气泡消失。
(2)明胶液
配法:先称取明胶溶于500~800ml DEPC水中,加热搅拌助溶,待明胶完全溶解以后,加入甲明矾溶解后即可使用。注意,包被玻片时,明胶液温度最好保持在60℃左右,效果最佳。方法同PLL包被玻片。
2.多聚赖氨酸包被玻片的制备方法(其它包被剂相同)
(1)将事先准备好的经160℃以上烘烤,并冷却至室温的玻片(载片或盖片),在0.05%(也有用0.1%)的PLL液中上下浸蘸几下,分散开竖放在架子上,于空气中自然干燥,4℃备用。注意:①浸蘸时,务必使整个玻片完全浸于液体中,否则,包被不完全会产生标本脱落现象;②干燥过程中注意避免尘埃污染;③按上法处理的玻片通常可存放在一定时间(室温1月以上,4℃更长),但仍建议尽早使用。
(2)多聚赖氨酸1mg溶于10ml灭菌的去离子水或1mmol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH7.0),将其涂布于玻片上,待干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。
(3)将PLL工作液滴至盖玻片上5μl/片,用另一盖玻片以推血涂片方法推片,或用另一盖玻片紧贴于其上,相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片,只有一面是包被有PLL,故制备时,待其晾干后,应作好记号,然后保存后备用。
多聚赖氨酸可用于多种核酸杂交,方法简单,结果可靠,有许多其它方法不可比拟的优点。配制好的液体可存放于4℃或室温,但时间过长会解聚而失效,故建议使用时尽量新鲜配制。
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责任编辑:何辉
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