1.准备工作
该检测是在96孔微板上进行,每孔均先用链霉亲合素包被,分别依次加入待进行表位作图的肽系列,并用需定位的抗体检测。
2.试剂和溶液
0.1%PBS-Tween;
2%BsA/PBS;
0.1%(wt/v01)BSA/PBS;
肽;
过氧化物酶标记的第二抗体;
TMB底物(取50/xl 50g/LTMB储存液,加入5ml 0.1m01醋酸钠,pH 6.6,另加1ul过氧化氢);
100 btmol硫酸。
3.操作步骤
(1)干肽溶于100%DMSO中,使其贮存液的浓度为10mg/m1,工作液的终浓度为lmg/ml,贮存于—70℃。
(2)用5/Ig/m1链霉亲和素(去离子水稀释)包被96孔板每孔50pl,注意设立复孔。37℃孵育过夜。
(3)用0.1%PBS-T洗板4次,用2%BSA/PBS封闭非特异性结合位点,室温2h。用0.1%PBS-Tween洗涤。 .
(4)将肽用0.1%(重量/体积)BSA/PBS稀释至终浓度为5/(g/m1(用工作原液的1/200稀释),每孔加入50txl肽溶液,湿盒置室温孵育2h或者过夜。
(5)从孔中吸去肽,并用0.1%PBS-T洗板4次。
(6)加入待测抗体。如用杂交瘤细胞培养上清液,可用原液或稀释1/10倍(用0.1%PBS-T)稀释。多克隆血清应稀释至1/200—1/2000进行试验,而纯化抗体应该在1—10bg/ml。
(7)孵育2h或过夜,吸去抗体溶液,用0.1%PBS-T洗板4次。然后加入过氧化物酶标记的二抗(兔抗鼠IgG单克隆抗体,用5%FCS/PBS作1/1000稀释),室温孵育2h。
(8)洗板4次,加入TMB底物,每孔50/J1,即50ml(50g/L)TBM储备液中加入5ml醋酸钠pH6.6及lml过氧化氢。
(9)出现蓝色时,加入lOOmmol/L硫酸50/1l终止反应。在450nm波长下测其OD值。
在一个成功的实验中,一系列肽根据表位的大小以及所选择肽的重叠程度,其中1个、2个或者3个肽可以得到强阳性的信号。例如,一个长度为15个氨基酸的肽链,有5个氨基酸重叠,那么,有些抗体可以与定位于5个氨基酸中的3个肽结合即产生强阳性信号。相反,另外一些抗体,与位于10个氨基酸表位中的2个肽结合产生阳性信号。某些抗体(极少数)仅对整条肽链显示1个阳性信号。这就意味着,氨基酸对于表位是至关重要的,常常定位于抗原的15个氨基酸区域中。
如果其他肽的背景染色很浅,可以认为就是很好的内在对照。一般而言,阳性肽不加试验性一抗,仅加检测试剂,应没有任何特异性信号。如果需要的话,表位分析可以通过氨基酸替换新的肽系列进行试验,一般使用丙氨酸(alanine)进行每一氨基酸位点的替换(在某些情况下,亦可以替换其他19个氨基酸)、转位替换一段肽或者重复氨基酸片段。