基本原理
Sano等(1992)率先利用基因工程的方法表达了A蛋白与链霉亲和素的嵌合体分子获得成功，建立了免疫PCR技术。这是一种新的抗原检测系统，利用细胞工程和基因工程技术，巧妙地将抗原抗体反应的特异性同PCR的敏感性相结合，通过构建单克隆抗体与重组核酸的嵌合体分子，使得利用PCR技术检测蛋白成为可能。随后在免疫PCR的基础上，建立了在细胞或组织原位检测抗原的原位免疫PCR(in situ immuno-PCR)。
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原位免疫PCR是一种检测系统，需要一种中介分子同时具有与DNA和抗体分子特异性结合的能力，其一端连接DNA，另一端连接抗原—抗体复合物，形成一个抗原—抗体—DNA连接物。作为标记的DNA分子用PCR扩增，检测特异的PCR产物，即可间接证明抗原的存在。该技术与原位PCR不同，就是在PCR与原位杂交之间加了抗体的因素。原位PCR是先对切片或涂片进行PCR，以对组织细胞内的DNA或RNA进行扩增，使其拷贝数大大增加，然后再进行原位分子杂交。而该技术是先用特异性抗体(单抗)与相应或目的抗原反应。这个抗体在对抗原反应之前加上了人体不存在的或无关的DNA序列。抗体与抗原特异性反应后，用PCR扩增加在抗体上的DNA序列，然后再用该DNA序列的探针进行杂交检测，也就是说用PCR及杂交的方法来放大免疫组织化学的反应，检测目标是蛋白质。
操作流程
(1)4um石蜡切片常规脱蜡至水。
(2)0．3％H202处理20min；PBS洗3min×3。
(3)抗原修复，或3mol/L酶消化；PBS洗3rain×3
(4)加入特异性一抗，37℃，1h；PBS洗3min× 3。
(5)加人生物素化二抗(1：400)，37℃，1h；PBS洗3min× 3。
(6)加入链霉亲和素(1：100)，37℃，1h；PBS洗3rain× 3。
(7)加人生物素化pUCl9 DNA；20ng/片37℃，1h；PBS洗3min× 3。
(8)PBS洗，进行原位PCR反应(在原位PCR仪上进行)。50×反应液中含25umol/L引物1ul，2mmol/L dUTPs(1mmol/L dTTP和生物素—dUTP、20mmol/L dATP和dCTP)各lul，10X缓冲液5ul，Taq酶2U。原位PCR程序为：94℃，40s；55℃，40s；72℃，20s；循环30次，最后72℃延伸5min；PBS洗3min×3。
(9)加入链霉亲和素—HRP(1；200)，37℃，30rain；PBS洗3min×3。
(10)DAB+H202显色。
(11)常规苏木精衬染和封片。
应注意的问题
(1)防止非特异性染色。所用的外源性DNA片段和引物必须和人体内基因或被检靶细胞中无互补系列，防止非特异性结合，出现假阳性。
(2)采用尿素或微波抗原修复方法替代酶消化切片，避免微量残存蛋白酶对Taq酶的降解，影响PCR扩增的效率，使敏感性下降。
(3)防止脱片，充分洗涤，防止非特异性结合和扩散。
(4)必须设计各种阳性和阴性对照。
以上方法主要是增加免疫组化敏感性的方法，当然再敏感也应保持特异性，不然提高敏感性就毫无意义，敏感性是在保留特异性的基础上发展起来的。
