免疫金标记检测方法标准操作程序(2)
时间:2010-01-02 02:47|来源:实验室前沿| 分享|点击:次
[3] 以柠檬酸为还原剂制备5—6 nm直径胶体金(Au 6) 将l ml氯化金加入100 ml 3DW中煮沸，快速加进2．45ml柠檬酸—单宁酸的混合液(2 ml 1％ 柠檬酸三钠、0.45 ml 1％ 单宁酸)，继续煮沸5 min，放室温待用。
[4] 白磷为还原剂制备5 nm直径的胶体金(Au 5) 将120 ml 3DW、1.5 ml％氯化金和2.7 ml 1 mol/L K2CO3，混合，缓慢搅拌中快速加进l ml白磷一乙醚溶液，室温轻搅拌15 min，100℃水浴30 min后放室温待用。
胶体金制备一般需在中性pH(7.2左右)条件下进行，也可在稍偏酸或稍偏碱的环境中进行。制备的胶体金其大小和形状可在电镜下观察确定。一般胶体金溶液呈红葡萄酒颜色，大颗粒胶体金是紫红色。正常情况下，胶体金溶液应清澈而不含任何可见的沉淀或漂浮物，如溶液、试剂、瓶皿等不干净。将造成如下结果：第一不能获得预期大小的胶体金颗粒，第二将影响到下一步生物大分子的吸附过程和包被后胶体金的稳定性。因此，为了获得满意的胶体金，应选择最纯净的各有关试剂和液体。如有条件，所有试剂最好经过超过滤处理，以除去其中的分子聚合体和可能混入的杂质块。制备过程中所用的水以三蒸去离子水最合适，各类器皿均应严格清洗，盛胶体金的瓶皿先经过硅化则更为理想。胶体金颗粒在吸附生物大分子之前具有一定的稳定性，4℃可存放一周左右，如果经超过滤和透析处理后加0.002％ 叠氮钠，能保存5个月左右。
4. 胶体金和生物大分子的结合
任何蛋白质都能结合到胶体金颗粒表面，胶体金和蛋白质结合后，并不影响蛋白质的反应性。
[1]生物大分子的准备 盐类成分能影响胶体金的吸附能力，并使胶体金颗粒发生聚集，因此，生物大分子在包被金颗粒前，常需透析，使溶液无盐或盐的浓度极低，常用的透析液为0.003ml/L NaCI。
[2]胶体金颗粒的包被 以生物大分子包被胶体金颗粒时，首先需要确定其精确用量，即蛋白质完全包被胶体金所需蛋白质的最小剂量。因为过多或过少地结合生物大分子均可使胶体金呈不稳定状态，它们的最佳浓度可通过如下方法获得。
制备好的胶体金以0.1mol/L K2CO3，调pH至6.2(SPA的等电点)待与SPA结合。用一个滴定盘或一排小试管，以0.005mol/L NaCl连续稀释50µl SPA(1mg／m1)至第十孔或第十管为止。然后，分别于每孔中加入250µ1的胶体金，5min后再加入250µ1 10％ NaCl，l min后震荡试管，这时SPA浓度较低的孔中，胶体金由红色变为紫色，说明SPA的量不足以包被胶体金。以胶体金未改变颜色，且SPA浓度最稀一孔胶体金与SPA的比例，计算出全部胶体金溶液所需SPA的总量，最后以10～20％过量加入到胶体金中，结合2—5min，再加入1％ 聚乙二醇(MW 20，000)至最终浓度为0.05％，以进一步稳定包埋后的胶体金。
[3]胶体金的浓缩纯化及储存 包被好的胶体金可用离心的方法使稳定的金颗粒沉淀于管底，而与多余的蛋白分开，使探针得以浓缩和纯化。将SPA—金颗粒复合物加到几个洗净的离心管中，再于离心管底部加进3—6 ml 5％ 甘油、0.05％聚乙二醇、0.02％叠氮钠的混合液垫层。纯化2—5nm的金探针时，以125，000×g离心45min(4℃)；纯化8～15nm直径金探针时，以60，000×g离心45~60min(4℃)。离心后SPA—金颗粒复合物浓缩于管底部，呈暗红色，尽量吸去无色上清后，收取暗红色层，而紧挨管壁的致密凝集块不应收集。浓缩纯化的胶体金探针置4℃保存待用，有效期约6个月。
【临床应用】
应用范围 包括感染性疾病抗原、抗体检测，如HBsAg、疟原虫抗原、TB—Ab、HP—Ab、HIV—Ab等；各种蛋白质抗原检测，如AFP、CEA、肌红蛋白、肌钙蛋白、尿微量白蛋白、OB等；激素检测，如HCG、LH、FSH、TSH等；药物检测，如吗啡、******等。适用范围一般为定性试验。
【金标记方法学特点及质量控制】
特异性与ELISA相似，敏感性略低于ELISA。定性检测时单个操作(NC膜条或NC反应块)、检测快速(胶体金本身为红色，不需加发色试剂，阳性反应即出现红色斑点或条带，整个操只需5—30分钟)、操作简便(蘸取或滴加标本、试剂即可)、不需特殊设备(手工)、结果明确(显红色，肉眼观察)，且金标记物稳定，冷冻干燥后可在室温长期保存。金标记方法学尤其适合个人保健、床边检测、基层卫生单位检测、急诊检验、新项目小标本量筛查等。
金标记方法学的局限性在于不易准确定量(变异系数大)、不易自动化分析、试剂成本偏高及质量控制困难。金标记法商品化试剂盒众多，无统一管理，存在问题有：
1.命名与方法学有时不符，方法学表示不明确，包被物与检测物表示不明确。
2.各厂家生产产品质量不一，无比较尺度。
3.试剂盒没有标出敏感性(有时即使标出也不相符)及检测上限(有发生前带)，敏感性及临界值标准不统一，造成一些疾病诊断上的假阴性、假阳性。
4.结果不稳定、重复性不满意，试剂盒应有低浓度标准测试重复性。
5.室内质控无有效方法：试剂盒中质控点或质控线中包被的是与标记结合物能直接结合的物质，仅能作为试验过程是否有效的参考指标(标记结合物是否失效、层析过程是否正常、被测物中有无干扰物质等)，不能反映敏感性、特异性、重复性等质量指标；室内质控应有质控物(应有低浓度)经常检测试验条(卡)有否呈色、呈色时间、呈色深浅，将敏感性及敏感性改变作为质控要点。
6.没有试剂盒批检。
【半定量与定量】
在测定一般正常体液中存在而在疾病时升高的物质时，如单以超过正常参考值上限为阳性界限往往不能满足临床要求。胶体金显色深浅与被测物浓度有一定相关性，因此可对被测物进行定量检测。
【金标半定量】
1.DIGFA：可用标准色阶对比法及质控标准对照法。标准色阶对比法是以与被测物浓度相对应的深浅不同的色带板与被测反应板显色斑点对比估计被测物浓度；质控标准对照法是以质控品同时测定对比色泽半定量。
2.DIGCA：可用质控线对比法及多条测定线法。质控线对比法质控线色泽为临床临界浓度显色。多条测定线法在NC膜上置多条受体线(抗体或抗原)，显色线条数与被测物浓度相关，或显色线第几条与被测物浓度达到多少浓度相关。
【金标定量】
1.DIGFA：膜上斑点免疫金标显色终点时用光电比色，
2.DIGCA：由于反应在NC膜上呈横流推进，测定线上反应出现的颜色逐渐加深，液流速度、反应温度等为可变因素，很难在规定时间得到恒定结果。
