1．热修复方法
(1)微波法 96~C，10minX2。
(2)直接加温法 100~C，10min。
(3)水浴锅法 100~C，10minx2。
(4)高压锅／消毒锅法 120~C，5min。
(5)真空加热法 10min。
修复方式对结果影响不是很大，主要与修复温度有关，但以微波和水浴锅法较为稳定。
2．热修复的介质
(1)0。01mol／lpH6．0柠檬酸缓冲液(CB)
(2)0．05mol／lTris—HCl(pHI～12系列)。
(3)0．01mol／l pH7。0 PBS。
(4)2％硫酸铝。
(5)2％硝酸铝。
(6)生理盐水。
(7)蒸馏水。
(8)0．05mol／LpH8。0 EDTA。
(9)0．05mol／LTris-EDTA，pH9．0。
文献报道多数认为溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而pH值则影响较大。缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris—HCl较常用。
3．温度与修复时间的关系
许多实验结果表明，温度越高修复时间越短，温度与修复时间呈负相关。例如K167和P-gp的检测，利用同一切片，达到相同的染色结果需要：①100~C，20min；②90~C，30min；③80~C，50min；④70~C，20h。
4．操作流程
(1)微波处理 将切片插人切片塑料架上，在250ml塑料盒内加入200ml缓冲液，用微波高档加温至96~C (大约1～2min)，并将切片移人修复液中，微波4挡保持96℃20min，取出自然冷却至室温。
(2)水浴锅法 热水浴是一种传统的抗原修复方法，调节水温使标本达95~C，将切片置人内含200ml缓冲液的塑料盒内，温度平衡后开始计时20min，取出塑料盒后自然冷却至室温。
(3)压力锅法 在高压锅内加入一定量的缓冲液，加温至煮沸，将切片插入切片架并置人锅内，盖上锅盖，不加阀，开始喷气时计时5min，关闭气阀，使之加压10min。压力锅置于流水槽中冲洗10min，冷却后取出切片，PBS洗涤。
5.最佳AR方法的测定
根据表2—6设计实验，依据设计处理后的IHC染色切片结果，选取阳性强度和阳性率最佳、抗原的定位准确、无非特异性染色的AR方法。
表2-6 选择最佳修复方法的实验设计
柠檬酸缓冲液 pills2 pH6 pHl0~11
Tris-HCl缓冲液 pills2 oH7~8 pHl0~11
微波 100~C 10minX2 切片l 切片2 切片3
压力锅 120~C 10min 切片4 切片5 切片6
微波或水浴锅 90~C 30min 切片7 切片8 切片9
切片10作阳性对照，不作任何处理
6.应注意的问题
在操作过程中还应注意如下问题。
(1)热处理后应注意自然冷却。
(2)热处理液不要蒸发干。
(3)不要任何抗原的检测都使用该方法。
(4)同一批抗原的检测温度和时间一定保持一致。
(5)形态学结构的改变。一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核的影响较大．会出现核破裂、苏木精淡染等现象。而经酶水解的切片，其细胞浆破坏要视消化时间而异．但核的破坏较轻。
(6)如果用常用的缓冲液无法实现抗原修复，或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液或加一些螯合剂(如EDTA和EGTA等)，均可改善某些抗原的修复。
