一、戊二醛二步法
1. 原理
戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 内容来自实验室前沿网站
2. 标记步骤 sysqy.com
（1）称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 实验室前沿，了解实验室动态
（2）反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。 sysqy.com
（3）将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
（4）用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。 实验室前沿，了解实验室动态
（5）加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
copyright sysqy.com
（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃ 1小时。 sysqy.com
（7）3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。 sysqy.com
（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
3. 结果判定 sysqy.com
（1）定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。
（2）定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。 内容来自实验室前沿网站
酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4 实验室前沿，了解实验室动态
IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 copyright sysqy.com
（3）本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2-4%的酶与蛋白质结合。
4. 试剂及器材
实验室前沿，了解实验室动态
（1）0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。 内容来自实验室前沿网站
（2）1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS 1ml混合。 sysqy.com
（3）1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
本文来自实验室前沿
实验室前沿，了解实验室动态
4. 试剂及器材 本文来自实验室前沿
（1）0.1M NaIO4：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。
sysqy.com
（2）1mM PH4.4醋酸钠缓冲液：0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml；0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml；加蒸馏水至2,000ml。
内容来自实验室前沿网站
（3）0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液：Na2CO3 0.32g；NaHCO3 0.586g；加蒸馏水至50ml，再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。 内容来自实验室前沿网站
（4）NaBH4溶液(4mg/ml)：临用时称取NaBH4 4mg溶于1ml蒸馏水中。 sysqy.com
（5）其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。 内容来自实验室前沿网站
三、工作浓度的选择
内容来自实验室前沿网站
在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
1. 酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。 sysqy.com
2. 其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成1:100，1:200，1:400，1:800，1:1600(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H２SO4 0.05ml终止反应。
3. 结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值，并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
四、注意事项
1. 在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高、效价高(最低1:16)、纯度高、亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。
2. 所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。 sysqy.com
3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。 内容来自实验室前沿网站
4. 浓的标记物相当稳定，常加入30-40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1-2年，但稀释成1:10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。 sysqy.com
