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免疫金银染色双PAG操作方法

时间:2011-07-12 01:00|来源:实验室前沿| | 分享|点击:


免疫金银染色方法敏感、简便、省时、安全可靠,葡萄球菌A蛋白(SPA)金标记四步法是在此基础上发展起来的更为敏感的一种新方法。SPA和许多哺乳类动物IgG具有亲和性,且它们之间的连接不会干扰抗原—抗体的结合。简单的SPA金标记二步法后,第三步用抗SPA与SPA金表面分子通过Fab或Fc段相结合,结果结合更多的胶体金颗粒,再通过银增强,使原始信号得到几何级放大,其染色原理见图。

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双PAG免疫金银染色原理
 
    (一)染色流程:
    (1)石蜡切片常规脱蜡至水,0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×3min。
    (2)0.1%胰蛋白酶37℃消化20min,或抗原修复20min(98℃),自然冷却至室温。
    (3)0.05mol/L(pH7.4) TBS洗3×3min。
    (4)1%EA(卵蛋白)15min,不洗。
    (5)适当稀释的特异抗体室温4h或4℃孵育20h,或37C孵育30min。
    (6)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×5min。
    (7)0.02mol/L(pH7.4)TBS(内含0.1%BSA)洗10min。
    (8)1%EA 15min,不洗,滴加PAGlonm 1:40稀释,室温1h,
    (9)0.05mo!/L(pH7.4)TBS洗10min。
    (10)兔抗SPAIgGl:400稀释,37℃ 30min。
    (11)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min。
    (12)滴加PAGlonm 1:60稀释,室温1h,或37℃ 30min。
    (13)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min。
    (14)1%戊二醛洗10min。
    (15)双蒸水洗5min。
    (16)1%明胶洗5min。
    (17)银避光显影8~15min。
    (18)双蒸水洗15min。
    (19)固定:用显影定影液(1:4或1:10)固定5min,也可以用15%硫酸钠—20%硫代硫酸钠混合液固定1~3rain,或用1%戊二醛固定5min,50℃温水洗3~6min。
    (20)衬染:核固红衬染3min或甲基绿衬染3min。
    (21)常规脱水,树胶封片。
    (22)镜检:阳性物质呈黑色或黑褐色,颗粒分布于抗原—抗体反应部位;背景较干净,呈红色。
 
    (二)双PAG法的敏感性
    应用本法对keratin、AFP、HBsAg、FN、SOD、HCG、F8、P53等组织抗原的定位,连续4gm石蜡切片,同时用IGSS和双PAG法,不同的一抗稀释度,结果双PAG法要比IGSS法敏感5~8倍,抗体的稀释度从1:  (1000~5000)提高到1:  (10000—50000),大大节约了第一抗体。尤其组织细胞内抗原性较弱,抗原丢失严重,应用双PAG法均能得到有效的检测,阳性检测率和阳性强度有了明显的提高。某些抗原用单一的SPA金标探针对某些抗原只能获得低强度的染色,当用双PAG法时可获得强的特异性染色。
Tags:操作,方法,金银,免疫,
责任编辑:何辉

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