免疫金银染色方法敏感、简便、省时、安全可靠，葡萄球菌A蛋白(SPA)金标记四步法是在此基础上发展起来的更为敏感的一种新方法。SPA和许多哺乳类动物IgG具有亲和性，且它们之间的连接不会干扰抗原—抗体的结合。简单的SPA金标记二步法后，第三步用抗SPA与SPA金表面分子通过Fab或Fc段相结合，结果结合更多的胶体金颗粒，再通过银增强，使原始信号得到几何级放大，其染色原理见图。
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双PAG免疫金银染色原理
(一)染色流程：
(1)石蜡切片常规脱蜡至水，0．05mol/L(pH7．4)TBS洗3×3min。
(2)0．1％胰蛋白酶37℃消化20min，或抗原修复20min（98℃），自然冷却至室温。
(3)0.05mol/L(pH7.4) TBS洗3×3min。
(4)1%EA(卵蛋白)15min，不洗。
(5)适当稀释的特异抗体室温4h或4℃孵育20h，或37C孵育30min。
(6)0．05mol/L(pH7．4)TBS洗3×5min。
(7)0．02mol/L(pH7．4)TBS(内含0．1％BSA)洗10min。
(8)1％EA 15min，不洗，滴加PAGlonm 1：40稀释，室温1h，
(9)0．05mo!/L(pH7．4)TBS洗10min。
(10)兔抗SPAIgGl：400稀释，37℃ 30min。
(11)0．05mol/L(pH7．4)TBS洗10min。
(12)滴加PAGlonm 1：60稀释，室温1h，或37℃ 30min。
(13)0．05mol/L(pH7．4)TBS洗10min。
(14)1％戊二醛洗10min。
(15)双蒸水洗5min。
(16)1％明胶洗5min。
(17)银避光显影8～15min。
(18)双蒸水洗15min。
(19)固定：用显影定影液(1：4或1：10)固定5min，也可以用15％硫酸钠—20％硫代硫酸钠混合液固定1～3rain，或用1％戊二醛固定5min，50℃温水洗3～6min。
(20)衬染：核固红衬染3min或甲基绿衬染3min。
(21)常规脱水，树胶封片。
(22)镜检：阳性物质呈黑色或黑褐色，颗粒分布于抗原—抗体反应部位；背景较干净，呈红色。
(二)双PAG法的敏感性
应用本法对keratin、AFP、HBsAg、FN、SOD、HCG、F8、P53等组织抗原的定位，连续4gm石蜡切片，同时用IGSS和双PAG法，不同的一抗稀释度，结果双PAG法要比IGSS法敏感5～8倍，抗体的稀释度从1： (1000～5000)提高到1： (10000—50000)，大大节约了第一抗体。尤其组织细胞内抗原性较弱，抗原丢失严重，应用双PAG法均能得到有效的检测，阳性检测率和阳性强度有了明显的提高。某些抗原用单一的SPA金标探针对某些抗原只能获得低强度的染色，当用双PAG法时可获得强的特异性染色。
