在组织或器官的免疫染色中遇到上述问题是很严重的。因此，选择最好的抗体用于组织染色极为重要。有些抗体在免疫斑点、免疫共沉淀甚至在培养细胞的染色中可获得满意的效果，但在组织免疫染色中可能是失败的。在免疫染色中遇到这些问题，主要是由于需在原位观察抗原，这样抗原就必须在其局部环境中被固定，但此过程容易使抗原表位受损，抗体的进入受阻，以及增强了低亲和力的交互反应。这意味着很难用单一的判断标准确证抗原的存在，同样也无法用其他的判断标准来证实抗原的性质，例如在免疫共沉淀或免疫斑点杂交中可根据蛋白分子的大小来推断其抗原性质，所以，必须特别注意选择合适的抗体并设计实验对照。 内容来自实验室前沿网站
一、抗原特异性
当选择抗体进行组织染色时，首先应考虑的是抗体与抗原结合的特异性。但是在通常使用的免疫学技术中，尚无可靠的技术可以很好地反映组织染色的条件。因此，没有直接的方法能证实抗体和标本中的其他抗原是否有交叉反应。在预实验阶段，可先将抗体用于相同组织来源样品的免疫斑点(变性抗原的表位)和免疫共沉淀(天然抗原的表位)，这样可确定主要的交叉反应，主要呈现的染色条带应该是所选用的抗体，与对照组比较，可证实抗体特异性的性质。
当进行免疫染色时，应设置各种对照，包括一个来自同一种属的阴性抗体对照，如果使用单克隆抗体，应与所用抗体同型。以及不加一抗的样本对照，其他试剂完全相同，用来区别信号与背景。
另一个检测抗原特异性的有效方法是使用两种或更多种的抗体，这些抗体针对抗原的不同表位，而且可以显示其差异性(第十章)。如果识别抗原不同表位的多种抗体显示相同的染色模式，其结果可提示信号是来自所研究的抗原。需要注意的是目的抗原也许与其他的相关分子具有相似的结构特征，如相同的蛋白家族，这样可能检测的是相关分子，而不是所研究的抗原，此时在免疫沉淀、免疫斑点对照中应该也出现交叉反应。
检测反应的特异性最好进行以下试验，一个来自野生型动物组织标本，另一个则来自所研究的抗原基因纯合子缺失(或者等位基因缺失)的动物组织标本，均用同一抗体进行染色。如果在基因缺失的标本中没有检测到信号，至少表明在野生型动物组织标本中观察到的信号是来自所研究蛋白的特异性表达。
另一特异性的检测包括对目的抗原的绿色荧光蛋白(GFP)染色模式或其融合蛋白染色模式、或与蛋白编码区表位标记的染色进行比较(第十章)。这一方法可提供一个完美的对照。
二、固定
组织固定往往是组织免疫染色中常出现的问题。有时一些抗体在培养细胞染色很好，但在组织染色中却失败。
在某些情况下，固定可阻断抗体与抗原结合。首先，固定可以改变氨基酸侧链的结构，如果这些侧链是抗原决定簇的部分，则抗体将不能发生作用。最常见于用甲醛或多聚甲醛固定时，当其与赖氨酸发生作用，形成交联结构而使抗原稳定地呈现。固定常使抗原变性，而且引起许多对变性敏感的表位缺失。
固定带来的第二个问题是妨碍抗体达到抗原部位。固定可以引起局部细胞环境中蛋白发生交联，形成稳定的结构不让抗体透入。如果固定剂中含乙醇和丙酮，可使局部环境中的蛋白发生交联，形成稳定的结构，影响抗体与抗原结合。
固定所带来的上述问题常难以控制，但是，研究者应该有清楚的认识，因为它在很大程度上影响实验的成功。许多不同的抗体需要通过实验找到一个不影响染色效果的固定方法。值得注意的是如果用经固定修饰的抗原免疫动物，所获得的抗体用于组织染色，将有助于克服由局部结构改变妨碍抗体与抗原结合的问题。
三、组织灌流
对于实验动物，为了保持其组织及细胞结构，常常在原位用固定液进行组织灌流。这些技术对软组织特别有用。用于组织的免疫染色标本有冷冻切片和石蜡包埋切片。目前有不同的固定液和灌流方法，可根据组织、抗原、动物的不同，选择不同的固定液和技术，参见Meek(1976)，Sternberger(1979)，BullockandPetrusz(1982)，PolakandvanNoorden(1983)。亦可根据具体试验过程选择灌流液。
