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HE染色法检测细胞凋亡技术

时间:2011-12-29 01:25|来源:实验室前沿| | 分享|点击:


凋亡检测中形态学方法是最直观、可靠的方法之一。对组织和各种细胞进行染色后,在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察,通过观察细胞的形态或染色的类型来判断凋亡的发生与否。 织梦内容管理系统

【材料及试剂】
(1)苏木素液:先将2.5g苏木素溶于25.0ml乙醇中,再将预先已溶有2.5g明矾的蒸馏水500ml加入苏木素乙醇溶液中,煮沸后将火焰熄灭,慢慢加入1.25g氧化汞,防止溶液溅出,再煮沸2min,将容器立即浸入冷水中,当溶液冷却后,加入20ml醋酸,室温保存,用前过滤。
(2)伊红染色液:取蒸馏水 75ml,先将少许蒸馏水加入0.5~1.0g伊红,用碾棒将伊红碾碎,再加入全部蒸馏水,溶解后加入95%乙醇25ml,最后滴入醋酸1~2滴。
(3)盐酸乙醇分化液:盐酸0.5ml,75%乙醇100ml。
(4)二甲苯,100%乙醇,95%乙醇,80%乙醇,75%乙醇,蒸馏水。
(5)甲醇,苦味酸,中性树胶。
(6)组织切片机,离心机,光学显微镜,离心涂片机。
【操作方法】
1、石蜡切片的HE染色
取一组织块,经甲醛或苦味酸固定24小时后,常规石蜡包埋,4um切片;
按以下方法脱蜡:二甲苯(I)5min,二甲苯(II)5min,100%乙醇2min,95乙醇1min ,80%乙醇1min,75%乙醇1min,蒸馏水洗2min;
苏木素染色5min,用流水冲洗;
盐酸乙醇分化30秒;
自来水浸泡15min;
伊红染色2min
脱水,透明及封片按以下步骤:95%乙醇(I)1min,95%乙醇(II)1min,100%乙醇(I)1min,100%乙醇(II)1min,二甲苯石碳酸(3∶1)1min,二甲苯(I)1min, 二甲苯(II)1min,中性树胶封片;
2、细胞涂片或细胞甩片的HE染色
细胞涂片或细胞甩片的制备:对于贴壁细胞,可将盖玻片放于培养器皿中,让培养细胞长于玻片上,然后用药物诱导细胞凋亡后取出,用4%多聚甲醛固定5min。对于悬浮细胞,用药物诱导细胞凋亡后,离心1000r/min收集细胞,用PBS洗2次,收集调整细胞数为1X105/ml,涂片或用离心甩片,用4%多聚甲醛固定5min;
染色与石蜡切片HE染色(3)~(7)相同;
【结果判断】
    在光学显微镜下,贴壁细胞由原来的梭形或多角形变小、变圆,核呈蓝色或蓝黑色,胞浆呈淡红色,核固缩、破碎,形成凋亡小体等。悬浮细胞,整个细胞皱缩,核固缩,破碎,形成凋亡小体,染色质颜色加深等。
  3、冰冻切片的HE染色
冰冻切片的制备:取一小块固体CO2至密闭的金属容器丙酮中,直至气泡冒完为止,将组织切割成小块,投入冰冻液中,然后切成5μm,空气中干燥,于-70℃可保存3个月;
染色与石蜡切片HE染色(3)~(7)相同;
【结果判断】
     光学显微镜下细胞核呈蓝黑色,胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布,核染色质致密浓缩,核固缩,核破碎,形成凋亡小体等。
Tags:凋亡,技术,细胞,检测,染色,法,HE,
责任编辑:何辉

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