荧光色素的荧光光谱和量子产率受环境影响，这也是众多荧光素具有探针作用的基础。影响因素主要有：
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1)荧光色素染液的pH：荧光色素是否发射荧光以及辐射何种荧光与它们在溶液中的存在状态有关。荧光色素均含有酸性或碱性助色团．溶液的酸碱性对它们的电离有影响，每种荧光色素有它最适宜的pH。一些荧光色素在pH 8．5～9．5g寸，发射荧光较强，例如1-萘酚-6-磺酸在pH 6．4～7．4的溶液中会发射蓝色荧光，当pH低于6．4时，则不发射荧光。
2)温度：荧光色素的荧光量子产率和荧光强度通常随溶液温度的降低而增加，如荧光素的乙醇溶液在0℃度以下每降低10℃荧光量子产率增加3％，降至－80℃时，荧光量子产率接近100％；反之则减弱，甚至导致荧光淬灭。但一般在20℃以下荧光量子产率随温度变化不太明显，故进行荧光染色过程中，要注意控制温度。但有些荧光染色如荧光抗体染色，在37℃时，温度对异硫氰酸荧光素的荧光效率无明显影响。
3)溶剂性质对荧光素的影响：溶剂性质对荧光素的荧光强度有明显影响，同种荧光素在不同溶剂中，其荧光光谱的位置和强度均有差别。荧光染色时常根据所需要的pH值缓冲液配制染液。
4)荧光素浓度的影响：荧光素浓度对荧光强度的影响更明显。在稀溶液中，荧光强度与荧光素的浓度呈线性关系；浓度增加到一定程度时，荧光强度保持恒定，即使再增加浓度，荧光强度也不发生变化；若浓度继续增加，超过一定限度后，由于荧光物质分子间的相互作用引起自身荧光淬灭现象，使荧光强度随着浓度的增加而减弱。荧光素染色的应用浓度一般为10－3～10－5mol/L。
由此可见，在进行荧光探针实验时，应注意合适的pH、温度、溶剂和荧光素浓度等条件。另外，染色液最好新鲜配制，先配高浓度储存液，临用前再稀释，避免因储存时间过长而失效。
