蛋白质抗原半寿期的测定
将免疫沉淀与其他的方法联用，可以确定蛋白质抗原的降解率。常用的方法有两种。第一种方法称为脉冲—追踪法。在培养基中加入放射性氨基酸，短期孵育，经脉冲标记后，该氨基酸掺入合成的蛋白质中；去除培养基中游离的放射性氨基酸，再以饱和量的未标记的氨基酸取代。在更换培养基后的不同时间，通过免疫沉淀对待检抗原进行追踪，放射性核素的衰变率代表标记抗原的降解率。第二种方法是在抗原进行放射性标记之后，加入某种药物封闭蛋白质的进一步合成，然后，定时进行免疫沉淀，可得到蛋白质抗原的转换率。
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药物控制法比较简单，但存在较多问题。如果某一物质影响待检蛋白质的半寿期，那么封闭蛋白质的合成就会阻止此调节因子发挥作用。因此，通过封闭蛋白质合成来测定半寿期仅可作为快速的预实验。正式实验时应该通过脉冲—追踪法测得蛋白质的半寿期。
(一)脉冲—追踪法测定半寿期
首先，在相对短的标记时段检测特异条带，确定所需要的标记量及合适的曝光时间。[35S]蛋氨酸至少需要lOmCi／5X106细胞。在追踪的不同时间点尽量缩短探测时间有助于很好地检测条带。尽管理论上脉冲标记的时间长度是任选的，但大多数的研究者将时间控制在1h内，最长2ho长时间标记会使细胞发生应激反应， 因为在生长中期会缺失一种关键的成分。另一个原因是避免长时间脉冲标记可缩短实验时间，否则脉冲标记和追踪的时间加上免疫沉淀的时间可超过一天。一旦标记抗原的条件成熟，即可开始脉冲—追踪实验。
将培养板中的细胞用放射性核素标记合适的时间，通常用[35S]蛋氨酸标记。移去有放射活性的培养基，以新鲜培养基洗涤细胞，然后以新鲜的完全培养基孵育细胞。通常采用短时间的脉冲。例如：1h内，在无血清的培养基中细胞即可被标记。对长时间的脉冲标记或采用的是依赖血清的细胞，要使用透析和滤过的血清。脉冲标记之后，在不同的时间点，收集各板中的细胞并且裂解之。每一个时间点的蛋白质都进行免疫沉淀，待所有时间点的免疫沉淀都完成后，免疫复合物通过SDS-PAGE进行分离。通过密度追踪、感光条带计数或磷光成像确定蛋白条带中放射活性的量。将不同时间点的放射活性在坐标图上找到对应的点，通过仔细计算，可以发现有3个点连成一条直线。这3个点可用来确定蛋白质的半寿期。确定连成直线的3个点是最基本的，因为在追踪阶段的早期，放射性蛋氨酸持续嵌入细胞内及衰变之间存在着一种平衡，只有在化合已经完成之后，才会有一个基本的衰变率。
一些研究者使用含有10倍未标记氨基酸的完全培养基。大多数培养基中蛋氨酸的浓度接近15mg／L，所以如果使用蛋氨酸，未标记蛋氨酸的最终浓度应是150mg／L。
细胞内蛋氨酸的储库相对较小，所以能直接获得有效的脉冲。但用其他氨基酸进行脉冲时，要先给予一个短时间的“饥饿”预处理，即在没有前体物的培养基中孵育，这个时间不要比脉冲时间长。
(二)药物封闭法测定半寿期
很多实验室已经报道通过使用蛋白质合成抑制剂启动追踪阶段来确定蛋白质的半寿期。通常使用的是放线菌酮，浓度为1～lOug／ml， 由高浓度的母液稀释而成。使用蛋白合成抑制剂处理后，在不同的时间进行简单的免疫印迹即可确定蛋白质的水平。此法仅适用于预实验显示脉冲—追踪结果与药物封闭相关的情况。文献中大量实例显示在有蛋白合成抑制剂存在时，蛋白质的转换有很大的不同。因此，最好选用前述的脉冲—追踪法。
