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AP融合蛋白的检测方法

时间:2011-04-18 00:27|来源:实验室前沿| 分享|点击:


(一).酶裂解测定法
 
1.在离心管中加入恒定浓度(1—5ug)的AP融合蛋白以及相应的能够结合此融合蛋白的抗亲和性结构域标签树脂。室温反应2小时,温和摇动。
2.5000g离心1分钟,弃去上清。用1mlTE重悬并再次离心。以TE和蛋白酶反应缓冲液分别洗涤树脂一次。
3.以200ul蛋白酶反应缓冲液重悬此洗涤过的树脂。为达到一个适合的反应速率所需的蛋白酶的量需要通过预实验进行测定。对于一个预实验,阳性对照和阴性对照的底物融合蛋白应该用一系列浓度的蛋白酶进行处理。
4.在不同的时间间隔,从反应体系上清中吸取20ul溶液转移到一个干净的离心管或微孔板中。合理地设置时间间隔,使之能够监测广泛变化的反应速率。例如,在反应的前10分钟间隔2分钟取样,之后的20分钟内间隔5分钟取样,然后在接下来的60分钟内间隔15分钟取样。
5.将10ul AP样品和90ul的AP底物溶液(根据生产商说明书制备)加入到一个单独的微孔板中。绘制纯化AP已知浓度的一个标准曲线。以合适的波长对反应进行监测,通常使用能够读取动力学数据的酶标仪。
6.测定反应的起始速率,通过与标准曲线比较计算出样品中释放的AP浓度。绘制出随时间变化而被酶切释放出的AP。如果底物浓度比K,值小得多,那么起始反应速率与底物连接序列酶切反应的是kcat/Km值是成比例的。
 
(二).底物连接序列的蛋白酶酶切位点的测定
 
1.进行类似实验方案7,2B中提供的酶切反应,在一个较小的体积中(50ul),使用更多  的AP融合蛋白(5~10ug)并捕获更多的树脂。加入足够的蛋白酶,反应足够长的时  间以消化底物连接序列,以酶切动力学数据作为参照。
2.SDS—PAGE以分离反应混合物。对于某些蛋白酶,建议在上样之前使用适合的试剂使  酶失活,  因为像类似枯草杆菌蛋白酶的酶类能够在变性和加热的过程中以非特异的方  式消化蛋白。
3.将蛋白从凝胶上电转化至膜上,染色显示切割后的AP产物,并用标准方法对其进行  NH2端测序。
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责任编辑:何辉

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