免疫电镜技术的包埋方法

时间:2011-04-16 01:52|来源:实验室前沿| 分享|点击:次

1.环氧树脂包埋将一定大小的组织片(免疫染色的切片)或未染色的组织块直接脱水，环氧树脂包埋后，制作超薄切片，进行包埋后染色，再经常规电镜样品制备处理；另外，包埋前染色的标本也可将切片贴在载玻片上，然后将充满环氧树脂的硅胶囊倒置于切片上聚合，原位包埋，类似于贴壁培养细胞的常规电镜处理。本文来自实验室前沿

2．低温包埋前面所述的环氧树脂包埋需高温聚合，易使组织细胞的抗原性丢失，因此在免疫电镜技术中，许多实验室着手研究低温包埋剂，尝试低温包埋方法，特别是20世纪80年代免疫细胞化学技术在电镜中广泛应用，加速了低温包埋剂的实验研究，许多低温包埋剂相继问世。低温包埋剂多为乙烯系化合物如Lowicryls、LRWhite和LRGold等，常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的包埋后染色，能检出应用环氧树脂包埋难以检出的多种抗原。现将常用的几种低温包埋剂及其应用简介如下：

（1）Lowicryls：Lowicryls是丙烯酸盐(acrylate)和甲基丙烯酸盐(methacrytate)化学物质，包括K4M、K11M、KM23等。其主要特点是在低温下(K4M：一35℃；K1tM和KM23：-60～-80℃)仍保持低黏度，并具有在紫外光(波长360nm)照射下聚合的能力。这种光聚合作用与温度无关，但实验中为保持包埋剂的低黏稠度，以利于其向组织细胞内渗透，要求在低温下照射。在这些包埋剂中，K4M和K11M具有亲水性，能较好地保持组织细胞的微细结构和抗原性，特别适于免疫细胞化学染色，且背景染色低，是超微结构定位组织细胞抗原的良好包埋剂。KM23为疏水性，图像反差好，较适于扫描电镜和透射电镜的暗视野观察标本制作。

1)包埋剂的配制：商品Lowicryls包埋剂由三部分组成，即单体(monomer)、交联剂(crosslinker)和引发剂(initiator)。调整单体和交联剂的比例，可制备软硬度合适的包埋块(包埋时多用硅胶囊代替橡胶或塑料制品，后两者影响紫外线的吸收)。配制比例

K4M 8．65g l7．30g 25．95g 34．6g

交联剂 1．35g 2．70g 4．05g 5．4g

引发剂 0．05g 0．10g 0．15g 0．20g

合计 10．05g 20．10g 30．15g 40．20g

一般可分别用注射器取包埋剂，置于玻璃烧杯内，天平称量，将三者按顺序加入后用玻璃棒轻轻搅动3～5分钟。切忌过分用力搅拌，以防产生气泡，影响包埋效果。

2)包埋：标本相继用65％乙醇0℃脱水1小时，80％乙醇-25℃脱水2小时，在1：1和2：1的LowicrylK4M包埋剂，／80％乙醇中，分别浸透1～2小时(一25℃)，在纯LowicrylK4M包埋剂中浸透2小时(-25℃)，更换纯LowicrylK4M包埋剂，浸透过夜(-25℃)，继而将新鲜纯包埋剂置于包埋模具内，将组织轻轻移人，以紫外线灯(波长360nm)距标本30～40cm照射24小时(-25℃)，使之聚合。聚合后的胶囊可移至室温，继续在紫外线灯下照射2～3天，以增加包埋块硬度，有利于制作优良的超薄切片。为缩短整个实验流程时间，也可采用快速包埋法．即仅聚合步骤在低温下进行，其余所有步骤在4℃或室温处理。

3)免疫染色：将制作的超薄切片(厚60—80nm)贴于镍网上，自然干燥，继之于湿盒内进行包埋后免疫染色(室温)，用金标记抗体或铁蛋白标记抗体作为第二抗体。必要时可用1％OsO4后固定30分钟(室温)，以增强切片的反差。

(2)LRWhite和LRgold：二者均为透明树脂，是一种混合的丙烯酸单体，黏度非常低，具有较强的嗜水性，故穿透性较强，有利于抗体和其他化学物质进入LR树脂内，与组织细胞抗原结合。因该类树脂具有良好的亲水性，所以，标本可不用完全脱水，至70％乙醇即可直接进行树脂包埋，有利于保持组织细胞的抗原性。LRgold是一种光引发的低温聚合包埋剂，聚合温度在-25℃左右，因聚合后呈金黄色而得名。该树脂能最大限度地保持组织细胞的抗原性．特别适于免疫电镜的抗原定位研究。LRWhite可在高温和低温两种情况下聚合，前者在60℃聚合24小时，后者在-25℃有加速剂存在的条件下聚合48小时．配制方法可参考产品说明书。样品处理和免疫染色同Lowicryl包埋齐剂。