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盖玻片上生长的细胞进行染色

时间:2010-12-13 01:47|来源:实验室前沿| | 分享|点击:


 检测的目的:检测范围大约为每个细胞表达1 000—10 000个抗原分子。 dedecms.com

一、特点
    快速简便;检测抗原的存在及定位;定性,半定量;灵敏度依赖于抗原量及位置;高浓度抗原,用低亲和力抗体也能检测。
 
二、操作步骤
    (1)在细胞染色前将盖玻片灭菌处理,将圆形盖玻片(广或1.5*)置于70%乙醇中,分别取出后火灼灭菌;
    (2)无菌环境中,用与真空装置连接的吸管将盖玻片转移入无菌组织培养板。真空装置可使盖玻片的吸起和移动更为方便;
    (3)将细胞悬液以低浓度接种于培养板中,培养过夜;
    (4)吸出培养液,将盖玻片用PBS洗一次,在此和以后的步骤中不需无菌;
    (5)吸出洗液,加入4%多聚甲醛(新鲜配制,见附录Ⅲ)固定细胞,室温孵育10min;
    (6)吸去多聚甲醛,用PBS洗涤2次;
    (7)将最后的洗液吸出,加入含0.2%TritonX100的PBS,以提高细胞的通透性,置室温作用5min;
    (8)吸出去污剂,用含0.2%TritonX—100的PBS,将盖玻片洗3次,各5min,弃净液体,但不要干燥,将每一盖玻片移入24孔培养板中;
    (9)加入25/11一抗,完全盖住盖玻片,室温孵育60min;注意不可使盖玻片接触培养板孔边缘。单抗常以未稀释的组织培养上清使用,腹水、纯化的单抗和多抗及多克隆血清在使用前实验室前沿均应测试其合适的稀释度。为了确定这一点,将抗体分别作1:10、1:100、1:1000、1:10000稀释,稀释液应使用含0.2%TritonX—100和3%BSA的PBS溶液。每个检测应包括3组对照:①与一抗同一种属、类型的无关抗体组,以检测染色的特异性;②未加一抗的对照组,以检测二抗染色的背景;③如果可能,用已知阳性样品作为阳性对照组。
    (10)用含0.2%TritonX—100的PBS洗3次,各5min,最后一次吸净液体,但不可干燥;
    (11)加入标记二抗25t~1,室温孵育20min;常用二抗为FITC标记的抗抗体。标记二抗在使用前,应预试其合适的稀释度,方法同(9);
    (12)用含0.2%TritonX—100的PBS洗3次,同上吸干;
    (13)在一干净和作好标记的载玻片上滴一滴封固液。用一尖头镊子将盖玻片取出。将盖玻片边缘置于一干净纸巾上蘸干液体。翻转盖玻片,使细胞百朝下,置于封固液上,慢慢实验室前沿网站放下盖玻片,与载玻片相邻的封固液一端接触,然后使盖玻片置于封固液上,这样可赶出气泡。观察前先空气干燥30min;
    (14)荧光显微镜下观察、拍照。
Tags:进行,细胞,生长,
责任编辑:何辉

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