(1)检验程序  检验菌株是否产生肉毒毒素，或污染食品中是否有产毒素的肉毒梭菌存可按图进行检验。

 

检样接种肝汤35℃培养3天    检样接种TPCYT肉汤2℃培养5天

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取液体部分7000r/min离心30min

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取上清中过灭菌

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血清学试验  禽眼睑闭合试验  小白鼠腹腔注射及中和试验

    (2)检验方法

    ①毒素提取和浓缩。取引起中毒的食品、饲料以及病死动物的胃内容物，用生理盐水做成悬液或取培养液的滤液500ml，可加5％明矾水溶液2．5ml(或l％羟基氯化铝5m1)。按一个方向轻轻搅拌5min，静置至结絮，经薄脱脂棉层过滤。用lo一15ml的水洗下结絮，以1000r／mir离心lmin(或待其自然沉降)，弃去上清液收集絮凝物，用pH6．5的o．2％明胶缓冲液溶解絮疑物。若室温超过25℃，应在冰浴中处理标本，以免毒素活性降低。

    ②小白鼠腹腔接种法。取15～25g的小白鼠分成3组，每组2～3只。1组：腹腔接种被检标本的稀释液o．5mi；2组：腹腔接种经沸水浴处理10min的被检标本稀释液o．5ml；3组：腹腔接种被检标本与等量不同稀释率的抗毒素混合液lml。观察2～6h，之后早晚2次，共观察4天。若1组的小鼠出现明显腹壁震颤、缩陷、“失声”(用镊子夹尾巴时不能叫)、随后呼吸困难、眼球突出、最后死亡；而2组、3组小鼠仍然健活。这表明被检标本中存在肉毒毒素。

    ③禽眼睑闭合试验。在投有小白鼠的情况下，可选用禽类(如鸡、鸽子等)，做眼睑注射。接种量可视禽的大小选用，一般注射0.1～0.3ml。具体操作：用蓝芯注射器从禽的内眼角向下注射眼险皮下。注射后眼睑隆起，几分钟后接种液被吸收，眼睑复原。然后视注入液中的毒素含量多少，导致闭合时间的早晚不同，毒素含量越多闭眼越快。如注入含量为几个小鼠致死量的毒素，一般可使试验动物在1-l0h内出现闭眼症状；如毒素量超过对禽体的致死量，则出现麻痹性瘫痪和呼吸困难等症状后经几十分钟到几小时死亡；如注射后20rain内出现死亡，应判断为注射失败。

    ④血清学试验

    反向间接血凝试验  用各型抗毒素致敏已固定、鞣化的人红细胞。即可用于毒素检测。本法可将毒素分型，且有较高的特异性和敏感性。

    对流免疫电泳  用pH8，6的巴比妥缓冲液配制1％的琼脂糖凝胶铺于7cm×10cm玻璃板上，打出相距6mm的两列孔。其中一列分别加入被检样品稀释液、标准毒素稀释液20,uL；另一列加入抗毒素血清20uL。在60mA、6～8V/cm条件下电泳45-60min，观察有无沉淀线出现。本法重复性好，但其敏感性不如反向间接血凝法。

 

    ELISA多用双抗体夹心法检测肉毒毒素

    其方法为在聚苯乙烯酶标反应板上先加抗毒素血清包被过夜，洗涤后，加入待检标本，37℃下孵育90min，再经洗涤后加入兔的抗毒素血清，37℃孵育90min，再次洗涤后加入羊抗兔IgG-酶结合物，37℃孵育90min，洗涤后加入底物溶液，其他操作同ELISA常规法。

 

    人类肉毒中毒主要有3种类型。a食物性肉毒中毒。主要是由于进食了含有肉毒毒素的食品引起的，也是人类肉毒中毒的最普遍的一种形式。b婴儿肉毒中毒。由于新生儿正常肠道菌群缺乏，其食人的肉毒梭菌芽孢可以萌发、繁殖、产生毒素，从而引起婴儿中毒。c创伤性肉毒中毒，类似于破伤风，由于伤口处污染的肉毒梭菌芽孢繁殖、产毒，毒素从伤口进入血液循环而导致，临床上较少见。

 

    肉毒中毒的实验室诊断和定型主要是依据肉毒毒素、病原菌的检出，在此基础上进行产毒试验和诊断血清的中和试验。按GB／T4789.12-2003的方法规定要求，一个在流行病学调查和临床诊断上已明确的食物中毒，其样品在实验室的确诊上所需的最少时间是10天。

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