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细菌的分离培养与接种技术

时间:2011-09-10 00:27|来源:实验室前沿| | 分享|点击:


绝大多数细菌在适宜的条件下可以生长,细菌感染性患者标本只有经过细菌的分离培养、鉴定和药物敏感试验,才可对感染性疾病进行病原学诊断并指导临床用药。因此,细菌培养对疾病的诊断、预防和治疗具有重要的作用。 内容来自dedecms

    细菌分离培养主要用于临床标本(如血液、痰、粪便等)或培养物中有多种细菌时对某一种细菌的分离。通过分离,可使细菌在平板上分散生长,便于观察单个菌落特性,也易于挑取单个菌落,进行生化鉴定。
    一、基本条件
    细菌分离培养的基本条件包括接种用具(接种环、接种针)、培养箱、培养基,以及无菌室和超净工作台等。
    ()接种用具
    包括接种环和接种针两类。接种环用来挑取标本、菌液及平板划线等。接种针则用来挑取单个菌落,穿刺高层琼脂等。接种环(针)由环(针)、金属柄和绝缘柄3部分组成,环(针)一般采用铂丝制作最佳,其硬度适宜,易于传热,火焰灭菌后冷却快,经久耐用。但因其价格昂贵,目前多用电热(镍)丝及l次性塑料接种环代替。
    接种环的直径一般为2~4mm,长5~8cm,定量接种环容量为1/300ml、1/200ml、1/100ml,用于定量培养。
    ()培养箱
    1.普通培养箱 可自动调节培养温度(一般为35~37℃),用于培养普通需氧或兼性厌氧菌。
    2.二氧化碳培养箱 可自动调节二氧化碳浓度(一般为5%~l0%)和培养温度,用于分离培养嗜血杆菌和奈瑟菌等生长时需二氧化碳的细菌,尤其是初次分离培养时。如无二氧化碳培养箱时,也可用烛缸法代替。
    3.厌氧袋、厌氧罐(盒)和厌氧手套箱用于分离培养厌氧菌。厌氧袋为透明的、不透气的塑料袋。厌氧罐为密封的塑料或玻璃罐(盒),可用物理或化学方法去除袋、罐中的氧气,达到无氧状态。厌氧手套箱则可通过换气装置快速达到、持续保持无氧状态,并自动调节培养温度,还可通过手套在箱内进行分离接种、生化鉴定等操作。
    ()培养基
    培养基(culture medium)是由人工方法配制而成的,****微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。适宜的培养基不仅可用于细菌的分离纯化培养、传代、菌种保存,还可用于研究细菌的生理、化学特性,是对病原菌分离鉴定的重要环节和必不可少的手段。培养基按其性状分为固体、半固体和液体培养基;按其用途分为基础、营养、选择、鉴别和特殊培养基。
    1.基础培养基(based medium) 含有基础生长所需的基本营养成分,最常用的是肉浸液,主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。基础培养基广泛用于细菌的增菌、检验,也是制备其他培养基的基础成分。
    2.营养培养基(nutrient medium) 在基础培养基中加入葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分,供营养要求较高的细菌和需要特殊生长因子的细菌生长。最常用的是血琼脂平板、巧克力平板等。
    3.选择培养基(selective medium) 在培养基中加入选择性抑制物质,有利于目的菌的检出和识别,而抑制其他非目的菌。例如,麦康凯琼脂平板可以抑制球菌及革兰阳性杆菌生长,有利于肠道菌生长,称弱选择性培养基;SS琼脂平板除有上述作用外,还可
抑制肠道非致病菌的生长,故称强选择性培养基。
    4.鉴别培养基(differential medium)利用细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同,在培养基中加入特定的作用底物和指示剂,用于观察细菌各种生化反应,以鉴别和鉴定细菌。例如糖发酵管、克氏双糖铁琼脂(KIA)、伊红-亚甲蓝(美蓝)琼脂等。
    5.特殊培养基(special medium) 包括厌氧培养基和细菌L型培养基等。前者是培养专性厌氧菌的培养基,除含营养成分外,还加入还原剂以降低培养基的氧化还原电势。后者是针对细胞壁缺损的细菌L型,由于胞内渗透压较高,故培养基必须采用高渗低琼脂培养基。
    二、接种分离技术
    为了从临床标本中分离出病原菌并进行准确鉴定,除选择好合适的培养基外,还要根据待检标本的来源、培养目的及所使用培养基的性状,采用不同的接种方法。
    (一)平板划线分离法
    使标本或培养物中混杂的多种细菌在培养基表面分散生长,各自形成菌落。一般要求单个菌落是一种细菌的纯培养。但很多情况下单个菌落并非只有一种细菌,特别是标本直接划线的开始区域生长的单个菌落分离结果不纯,一般选择菌落形成较稀少区域的单个菌落,必要时先稀释标本再划线。待菌落长出,后,挑选单个菌落,转种到另一培养基中,继续实验。平板划线法可分为以下几种:
    1.分区划线法此法多用于粪便等含菌量较多的标本。先将标本均匀涂于平板表面边缘一小部分(第1区);然后烧灼接种环,将环通过第l区3~4次,连续划线(为第2区);依次划3、4区。平板上每l区的细菌数会逐渐减少,直至分离出单个菌落(图5-4)。
   2.连续划线法 本法一般用于接种含菌数量相对较少的标本或培养物。先将标本均匀涂布于平板边缘一小部分,并由此开始,在平板表面连续划线并逐渐下移,直至划满平板表面。
    3.棋盘格划线法此法多用于含菌量较多的临床标本,如痰、粪便等标本的初代分离培养。其优点是整个平板的3/4~4/5区
(即棋盘格范围)均为有效分离区。将标本涂布于平板约l/5处,接种环经火焰灭菌后,自原处做平行划线5~6条。接种环烧灼后冷却,划垂直线5~6条,形成正方形格;再以同法划两排斜线,使呈棋盘形。
    ()斜面接种法  
该法主要用于纯种增菌及保存菌种。挑取单个菌落从斜面底部自下向上划一条直线,再从底部开始向上划曲线接种,尽可能密而匀,或者直接自下而上划曲线接种。
    ()液体接种法
    以接种环沾取菌种,倾斜液体培养管,在液面与管壁交界处研磨接种物(以试管直立后液体应淹没接种物为准)。多用于普通肉汤、蛋白胨水等液体培养基的接种。
    ()穿刺接种法
    此法用于保存菌种、观察动力及某些生化反应。以接种针挑取细菌培养物,插入半固体培养基的中央,穿刺至培养基底部,然后沿原穿刺线退出接种针。其他操作与斜面接种类似。
    ()倾注平板法
    取纯培养物的稀释液或原标本,混匀于已融化并冷却到50℃左右15ml的琼脂管中,无菌法倾注于无菌平皿,凝固后培养,进行菌落计数。该法适用于兼性厌氧菌或厌氧菌稀释定量培养,也用于饮料、牛乳和尿液等液体标本活细菌计数。
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责任编辑:何辉

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