实验室制备前器材和试剂

●  2YT／tet培养基

●  超级肉汤(Superbroth)／tet培养基：  24g细菌用酵母提取物，12g细菌用胰  蛋白胨，5m1甘油，加水至900ml，高压灭菌；加100mi经过高压灭菌的0．17mol／LK2HP04 0．72m01／L KH2P04 和5ug／m1的四环素

●  经过过滤灭菌的用超纯水配制的10％超纯甘油

●  磁力搅拌器：2英寸(1英寸＝2．54cm)

●  大肠杆菌SS320菌株

●  灭过菌的1．0mm01／L Hepes(N-[2hydroxyethyl]-piperazine-N^，-[2-ethanesul{onkacid]，N-2-羟乙基哌嗪-N，2-乙基磺酸；溶于超纯水)，pH 7，4

 

制备方法

1．从新鲜(时间不超过1周)的2YT／tet平板上挑取单个大肠杆菌SS320的克隆，接种到lml 2 YT／tet培养基中。37℃200r／min孵育6～8小时。转移培养基到含有50m1 2YT／tet培养基的500ml带塞锥形瓶中。37℃200r／min培养过夜。

2．将5m1过夜培养基接种于分别含有900m1超级肉汤／tet培养基的6个2L带塞锥形瓶中。37℃200r／min培养细胞至OD600＝0。6-0．8(3-4小时)。

3．冰上冷却3个锥形瓶5分钟，间歇涡旋混匀。

    注意：下面的步骤应该在4℃冷室，冰上完成，并且使用预冷的试剂和仪器。

4．用GS3转子(5000g)4℃55000r／rain离心细胞5分钟，最好使用可以迅速降速的离心机(例如Sorvall RC5B Plus)，弃去上清。将剩下3个锥形瓶中的培养基(当第一组正在离心时，它们应该处于冷却环境下)加入到相同的管子中，重复离心并弃去上清。

5．用pH 7．4，1．0mmol／L的Hepes装满每个离心管。加入一个无菌的磁性转子到每管中以促进沉淀重悬。简短地涡旋振荡冲下管壁上的沉淀并以一个温和的速度搅拌至沉淀完全重悬。

6．用GS3转子4℃55000r／min离心10分钟，弃去上清。在倾倒过程中，将搅拌棒留在离心管中，使其留在与沉淀相反的一面。  当从转子中取出离心管时，  小心维持离心管的角度以免搅乱沉淀。

7．用同样体积的1．Omm01／L的Hepes(如第5步)重悬细胞。用GS3转子4℃S5000r／min离心10分钟，弃去上清。用150mll0％超纯甘油重悬每个沉淀。不要把沉淀混在一起。

8．用GS3转子4℃55000r／min离心细胞15分钟。弃去上清并拿走搅拌棒。用移液器去掉剩余的少量上清。每管加入3．Oml 10％超纯甘油并用移液器重悬沉淀。转移悬浮液到另外一管并重复操作，使所有沉淀都重悬浮。

9．将350ul的一份分装于1．5m1微型离心管中的液体快速冰冻。这个实验方案能制备约12m1浓度为3×10¹¹cfu／ml的细胞。

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