［摘要］ 目前厌氧菌的致病性及其相关研究备受关注，但厌氧菌难培养且时间较长，造成厌氧菌的培养、鉴定和厌氧菌感染的诊断非常困难。近年来，分子生物学技术如荧光探针杂交、rRNA基因序列测定、PCR扩增限制性酶切片段多态性分析、变性梯度凝胶电泳、实时定量PCR等在厌氧菌的研究中已得到较好的应用，成为厌氧菌研究不可或缺的手段。本文对其最新研究进展作一综述。
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［关键词］ 厌氧菌；分子生物学技术
The application of molecular biological techniques in the study on anaerobic bacteria
CHEN Tian-Bao1,2 CHEN Jian-Kui1
1．.The Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071
2. Institute of liver disease，General hospital of Beijing military district，Beijing 100700
［Abstract］ The isolation and identification of anaerobic bacteria are often difficult because most of them grow much slower than the facultative or aerobic bacteria. Molecular genetic techniques were developed rapidly, which can be used to diagnose infections due to anaerobic bacteria. Since their time saving and highly differentiation rate, molecular genetic methods have been widely used in the study of anaerobic bacteria. This review summarized the applications of molecular genetic methods to anaerobic bacteria research.
［Key words］ anaerobic bacteria; molecular biological technique
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近年来有关厌氧菌的研究引起人们极大兴趣：如厌氧菌（如双歧杆菌）作为载体治疗肿瘤的研究；乳杆菌、双歧杆菌作为益生菌的应用；抗生素相关性腹泻的研究；厌氧菌感染引起牙周疾病的研究等 。厌氧菌血症（单独感染或与需氧、兼性厌氧菌混合感染 ）、厌氧菌的耐药性及厌氧菌的快速诊断等许多迫切要求解决的问题备受关注[1]。
目前临床常用的厌氧菌培养方法有简易厌氧袋培养法、厌氧罐培养法和厌氧手套箱培养法等。商品化供应的产品,如法国生物梅里埃公司生产的GENbag、GENbox和英国Oxoid公司生产的Oxoid厌氧罐、Oxyrase酶平皿厌氧菌培养系统（美国Oxyrase公司生产）等已在临床得到应用。商品化的厌氧鉴定系统API 20A、 Rapid ID32A、API-ZYM和VITEK-ANI等可用于厌氧菌的鉴定[2]。虽然培养法鉴定厌氧菌是一种可靠的常规方法，但受标本采集和运送方法的影响较大，且成本高（几乎每一种厌氧菌都有其专用的选择培养基）、需时长。因此，非培养诊断法（尤其是分子生物学方法）如荧光探针杂交、16S rRNA基因序列测定、PCR扩增限制性酶切片段多态性分析、变性梯度凝胶电泳、实时定量PCR等在厌氧菌的研究中得到较好地发展，现综述如下。
1厌氧菌相关基因研究
1.1厌氧菌毒素基因检测
一些厌氧菌能够产生特异性毒素，如破伤风杆菌的痉挛毒素、肉毒梭菌的嗜神经毒素、艰难梭菌的A、B毒素等。检测相应毒素及其基因，可作为诊断厌氧菌感染的可靠方法。
艰难梭菌是革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，是近年来医院内感染性腹泻的重要病原菌。该菌感染的病人症状可从无症状携带者、轻微腹泻到可危及生命的假膜性肠炎。艰难梭菌主要致病因素是两种毒素TcdA、TcdB，但近来有二元毒素的报道。应用PCR方法可研究艰难梭菌致病基因tcdA、tcdB及其调节基因，多元实时定量PCR方法可同时扩增艰难梭菌毒素基因tcdA、tcdB，快速检测粪便标本中艰难梭菌[3]。有学者应用免疫色谱法(ICTAB)检测艰难梭菌相关性腹泻病人毒素TcdA、TcdB，实时定量PCR检测毒素基因tcdB，并与参考方法（Vero细胞毒试验）比较，认为这两种方法均可作为疑似艰难梭菌相关性病人的快速筛选方法[4]。
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脆弱拟杆菌是临床最常见的一种厌氧菌，是人类口腔、肠道和女性生殖道的正常菌群。它是一种条件致病菌，可单独或与需氧菌或兼性厌氧菌一起引起各种类型的感染，如脓肿、胸腔和颅内感染，甚至败血症。Robertson等应用基因克隆等技术研究脆弱拟杆菌溶血素（或溶细胞素）基因hlyA、hlyB的调节和协同作用，认为它们的表达受离子和氧调节，基因产物HlyA 和HlyB有协同溶细胞作用[5]。Sharma 等应用PCR法同时检测大便标本中产肠毒素脆弱拟杆菌的神经氨酸苷酶和肠毒素基因，并与培养法比较，认为对产肠毒素脆弱拟杆菌是否作为腹泻致病原值得进一步研究[6]。Franco研究脆弱拟杆菌的致病机制，发现产毒素脆弱拟杆菌株86-5443-2-2和非产毒素脆弱拟杆菌株NCTC 9343具有相似的接合性转座子，它们与以往发现的转座子有许多不同。作者认为如果这些转座子被证实是可转移的，则产毒脆弱拟杆菌株可以通过与抗生素抗性传播相似的机制将毒力基因传播给非产毒株[7] 。
肉毒梭菌与食物中毒有关，肉毒毒素是目前已知毒性最强的毒性物质。Shin等应用实时定量反转录PCR检测肉毒梭菌A型神经毒素的表达，认为此方法可以定量神经毒素的转录水平和评估食品防腐剂引起肉毒梭菌毒素污染的作用，并可用于临床肉毒梭菌中毒的检测[8]。
1.2抗生素耐药相关基因检测
不同种类抗生素对厌氧菌的抑菌作用不同。一些厌氧菌对氨基糖甙类抗生素具固有耐药性，脆弱拟杆菌组细菌能产生β内酰胺酶，可降解青霉素和头孢菌素类抗生素的β内酰胺环。随着抗生素的广泛应用，厌氧菌的耐药情况也日益突出。甲硝唑、万古霉素是常用的治疗厌氧菌感染的药物，但近来有甲硝唑治疗厌氧菌的疗效降低的报道。耐药性基因的研究是分子生物技术的一大优势。
Cassone等应用DNA芯片检测大环内酯类抗性基因，在脆弱拟杆菌V503 中不仅检出甲基化酶基因erm(FU)，还检出了外排泵基因msr(SA) (通常认为此基因存在于葡萄球菌中，在革兰阴性菌中不常见) [9]。Pumbwe 通过药物选择突变研究，应用实时定量反转录PCR检测多药抗性突变脆弱拟杆菌外排泵基因bmeB 的过表达情况，认为多药抗性株随治疗时间延长而增多[10]。Katsandri等报道两例多药抗性脆弱拟杆菌群株（同时具有克林霉素、四环素、头孢西丁、哌拉西林-泰巴坦、亚胺培南抗性，其中一株甚至对甲硝唑耐药），用PCR方法检测cfiA(编码金属β内酰胺酶)、nim（编码甲硝唑抗性）基因并测序，发现两株脆弱拟杆菌群株均携带cfiA[11]。Ackermann等应用PCR和DNA测序研究艰难梭菌对大环内酯-林肯(酰)胺-链阳性菌素(macrolide– lincosamide–streptogramin B,MLSB)相关抗性及与氟喹诺酮类抗性的关系，认为二者有相关性[12]。 Yu等应用实时定量PCR研究猪、牛粪便菌群四环素抗性情况，对10种主要四环素抗性基因进行扩增分析，认为实时定量PCR可以快速准确地应用于微生态学抗生素抗性研究[13]。
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2 菌群分布研究
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消化道、口腔、皮肤、女性生殖道是人体正常菌群的四大菌库。研究这些部位厌氧菌分布及其在病理生理条件下菌群变化情况，对临床诊断和治疗厌氧菌感染起到重要作用。
2.1 口腔菌群分布
基因芯片、实时定量PCR等技术已经用于口腔细菌组成及定量、口腔健康和口腔微生物菌群关系等的研究。 Munson等组合应用培养法和分子生物学方法（16SrRNA测序），研究龋齿病人龋齿中细菌多样性，鉴定出95种细菌（31种新菌），其中44种为分子生物学方法单独检出[14]。 Chhour等应用16SrRNA 基因PCR扩增、测序、系统进化分析研究10个龋齿晚期病人龋齿内牙本质细菌分布情况，认为PCR比培养法能获得更多的细菌，龋齿内菌群分布呈现多样性，乳酸杆菌属和普雷沃菌属占前两位，分别占50%和15%，并且龋牙早期定植的细菌对引起牙髓感染的致病性细菌起决定性作用[15]。
2.2 消化道菌群分布
胃肠道微生物具有高密度、多样性、相互间作用复杂的特点，荧光原位杂交、核糖体小亚基DNA克隆、测序及“指纹”识别技术在肠道细菌研究中得到广泛应用。日本两位学者应用末端限制性酶切片段长度多态性分析和反相高压液相色谱仪比较老年人和健康成人粪便中微生物菌群和多胺（腐胺、亚精胺、精胺）浓度的关系，认为粪便细菌与腐胺浓度有关，梭菌XIVa亚群对人体腐胺浓度控制起重要作用[16]。Ben-Amor等将流式细胞术和16S rRNA扩增后变性梯度凝胶电泳技术结合，用于粪便活细菌、受损细菌和死菌分类，为胃肠道微生态学研究提供了新方法[17]。
2.2 菌群分布与宿主基因间关系的研究
曾有学者应用气液相色谱技术研究鼠主要组织相容性复合体（MHC）与粪便菌群组成之间的关系，认为粪便菌群组成受基因控制。 Stewart等通过PCR扩增及梯度凝胶电泳研究同卵双生儿、异卵双生儿、不相关配对对照儿童粪便优杆菌分布情况，认为宿主基因不同可能影响细菌在肠道的定植[18]。
2.3 生理、病理状态下菌群变化的研究
人体的正常菌群一旦建立，就保持相对恒定状态，但也随生理、病理条件不同而不断变化。
2.3.1生理条件下菌群变化
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肠内微生物超过400种，其中大部分是细菌，而正常人肠道菌群中厌氧菌是优势菌群。Park等应用分子生物学方法包括16S rRNA扩增测序技术，研究新生儿肠道菌群的变化。作者发现婴儿肠道菌群在出生后几天内即发生快速变化，并且新生儿肠道菌群多样性随出生后天数而增加[19]。肠饲饮食能导致健康人的粪便细菌和短链脂肪酸浓度变化， Whelan等应用荧光原位杂交和气液相色谱仪研究加入寡聚果糖和纤维对这种变化的预防作用，发现肠饲饮食引起粪便细菌总量减少，肠饲饮食中加入寡聚果糖和纤维能促进双歧杆菌数量增加[20]。
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2.3.2 病理条件下菌群变化
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Dalby等通过给鼠皮下注射消炎痛试验发现消炎痛可引起肠道菌群变化。粪肠球菌显著增加，与艰难梭菌和鼠乳杆菌一起构成优势菌群，导致菌群失衡[21]。有学者采用实时定量PCR对社区健康老年志愿者和老年住院病人接受抗生素治疗者的粪便细菌进行研究，发现住院老年病人粪便中拟杆菌-普雷沃菌群明显降低，细菌16S rRNA 总拷贝数也普遍降低，抗生素导致细菌数降低。住院病人双歧杆菌、脱硫弧菌、梭状梭菌等也发现有下降，而机会性致病的肠道菌群数量增加[22]。Tongeren等应用荧光原位杂交和Groningen虚弱指数研究老年人虚弱情况和菌群变化的关系。作者发现体弱老人乳杆菌属、拟杆菌-普雷沃菌下降，肠杆菌科细菌升高[23]。Ott等应用单链构象多态性、实时定量PCR研究活动性肠炎病人的肠粘膜活检标本，发现肠炎病人细菌多样性减少，认为与正常厌氧菌减少有关[24]。Sakamoto等应用末端限制性片段长度多态性、实时定量PCR研究牙周炎病人牙周处理前后唾液和牙龈下菌斑中细菌的变化情况，发现治疗后牙龈下有多种细菌数量降低（牙龈卟啉单胞菌显著降低）[25]。Song等应用实时定量PCR研究孤独症儿童粪便中梭菌属变化情况，并与健康儿童比较，发现梭菌I和XI群明显升高 [26]。
3 厌氧菌血症标本鉴定
厌氧菌败血症病人预后较差，由于培养法检测厌氧菌需时较长，且在现有技术条件下许多厌氧菌无法培养成功，因此分子生物技术在厌氧菌的临床诊断中起到重要作用。应用16S rRNA基因末端限制性片段多态性分析和基因测序技术可快速鉴别诊断厌氧、无芽孢、革兰氏阳性杆菌菌血症，该法节省时间、降低广谱抗生素抗性的产生、减少菌血症的死亡率[27，28]。
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4 流行病学调查
分子生物学技术组合应用可以将细菌鉴定到属、种甚至株的水平，因此常在流行病研究中用来调查菌株流行情况，以确定传染源。艰难梭菌相关性腹泻在治疗停止后容易重新发作，是复发还是新感染？ Tang等通过随机引物PCR调查18例病人，认为重新发作不单纯是旧病复发，新感染也是普遍现象[29]。Fawley等应用三种DNA“指纹”识别技术，随机引物PCR（AP-PCR）、核糖体间区PCR（RS-PCR）、脉冲场凝胶电泳(PFGE)，对英国地方性艰难梭菌感染进行流行病学监测。他们在医院病房环境中分离出的艰难梭菌有14种基因型，但在病人粪便和环境表面仅可同时检测出3种。艰难梭菌 AP-PCR type Ia是优势株[30]。 Asha等应用分子指纹识别技术比较分析抗生素相关性腹泻病人艰难梭菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌的流行情况及危险因素。认为大于70岁是共同的危险因素，住院时间长短和艰难梭菌感染有关，抗酸剂的使用和女性患者是产气荚膜梭菌感染的危险因素，艰难梭菌引起的抗生素相关性腹泻高于产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌引起的感染[31]。 MacCannell等应用PCR核糖分型（ PCR-ribotyping ）和基因外回文重复序列（repetitive extragenic palindromic,REP) PCR分型对加拿大东、西部地区艰难梭菌核型027株流行情况进行分析，认为艰难梭菌核型027株在蒙特利尔暴发流行以前就已广泛存在 [32]。
5 环境污染污染源调查
粪便污染源（人源还是动物源性）的确定，对加强污染源的控制、改进排污措施、保护水源起到重要作用。化学物质和细菌可作为污染溯源的指示标志。若以细菌作溯源指示，分子生物学方法比培养法更为简便快速。肠道菌群中埃希菌属、克雷伯菌属曾作为指示标志，但宿主特异性不强。双歧杆菌属、拟杆菌属为近年研究较多的粪便污染指示标志。Bonjoch等应用16S rRNA 特异引物多重PCR扩增污水中双歧杆菌以鉴别污染源，发现青春双歧杆菌、齿双歧杆菌几乎为人类所独有[33]。Gueimonde 等应用实时定量PCR和荧光原位杂交研究人粪便中双歧杆菌，并在无菌鼠便中加入定量双歧杆菌来研究两种方法的检出限。作者以荧光原位杂交法为定量肠内菌群的“金标准”，认为实时定量PCR能更准确地检出低水平标本[34]。Dick等应用拟杆菌特异引物对人、牛、猪、毛、麋鹿、狗、鸥和马8种动物粪便标本进行部分16S rRNA序列扩增，结合限制性酶切多样性分析及测序用于水环境中粪便污染的调查，发现了猪、马特异性序列并设计相应引物用于鉴别粪便水污染[35]。
6 小结
如何快速准确鉴定厌氧菌感染仍是一个值得探究的问题，分子生物学技术结合培养法在厌氧菌检测中将发挥越来越大的作用，可发现和鉴定更多现有条件无法培养的厌氧菌，藉此对厌氧菌与人类疾病的关系做深入研究。
![嗜中性粒细胞来袭时的微细胞之战[图]](/uploads/allimg/090616/02113V132-0_lit.jpg)
