一、目的
明确人巨细胞病毒核酸检测的操作规程,指导检验人员正确进行人巨细胞病毒核酸的检测。 本文来自实验室前沿
sysqy.com
二、适用范围
sysqy.com
适用于进行人巨细胞病毒核酸定量检测的检验人员。 内容来自实验室前沿网站
内容来自实验室前沿网站
适合仪器:RG3000荧光PCR检测仪 内容来自实验室前沿网站
sysqy.com
方法原理:采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术 本文来自实验室前沿
实验室前沿,了解实验室动态
样品要求:血清 copyright sysqy.com
三、职责
copyright sysqy.com
sysqy.com
实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
本文来自实验室前沿
种类:新抽取的血清。 实验室前沿,了解实验室动态
本文来自实验室前沿
保存:待测血清在2-8℃保存,保存期不超过24小时;在-20℃保存不超过三个月;- 70℃保存,保存期半年。 本文来自实验室前沿
sysqy.com
最少样品量:100ul 内容来自实验室前沿网站
试剂及配套品:
本文来自实验室前沿
sysqy.com
样本处理试剂:DNA提取液1、DNA提取液2 内容来自实验室前沿网站
copyright sysqy.com
核酸扩增试剂:PCR反应液、Taq酶(5U/ul)、UNG(1U/ul)
实验室前沿,了解实验室动态
实验室前沿,了解实验室动态
对照品: 阴性对照、阳性对照
实验室前沿,了解实验室动态
阳性参控品: 阳性参控品1:(5-9)E7copies/ml 本文来自实验室前沿
内容来自实验室前沿网站
阳性参控品2:(5-9)E6copies/ml 实验室前沿,了解实验室动态
实验室前沿,了解实验室动态
阳性参控品3:(5-9)E5copies/ml 本文来自实验室前沿
实验室前沿,了解实验室动态
阳性参控品4:(5-9)E4copies/ml
实验室前沿,了解实验室动态
sysqy.com
四、工作程序
sysqy.com
1. 样本处理(样本处理区) 内容来自实验室前沿网站
sysqy.com
取待测样本血清以及试剂盒中的对照品各100ul,分别加到0.5ml离心管中;加入100ul DNA提取液1,振荡混匀,13,000rpm离心10min,弃上清;再加入50ul DNA提取液2,稍事振荡并将液体甩至管底,放入100℃干浴或沸水浴10min, 实验室前沿,了解实验室动态
13,000rpm离心10min,保留上清4℃保存备用(如需长期保存请放置于-20℃)。
copyright sysqy.com
2. 核酸扩增
sysqy.com
内容来自实验室前沿网站
2.1 试剂配置(PCR前准备区)
从试剂盒中取出各管试剂,稍事离心.设所需要的管数为n(n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照+4管阳性参控品),每个测试反应体系配制如下表: 内容来自实验室前沿网站
试剂 PCR反应液 Taq酶 UNG 实验室前沿,了解实验室动态
内容来自实验室前沿网站
用量 15.6uL 0.4uL 0.03ul 内容来自实验室前沿网站
计算好各试剂的使用量,加入一适当体积试管中,充分混合均匀,向设定的n个反应管中分别加入16ul,转移至样本处理区。 copyright sysqy.com
2.2 加样(样本处理区) 本文来自实验室前沿
sysqy.com
在所设定的n个反应管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、强阳性对照上清液以及阳性参控品各4ul,盖紧管盖,将反应管套放在离心机中,于2000rpm离心5sec,转移至检测区,置于RG3000-PCR仪上并纪录样本摆放顺序。 copyright sysqy.com
2.3 PCR扩增(检测区) 内容来自实验室前沿网站
2.3.1 循环条件设置:
copyright sysqy.com
本文来自实验室前沿
37℃:3min; copyright sysqy.com
本文来自实验室前沿
93℃:1min;
sysqy.com
本文来自实验室前沿
93℃:5sec,60℃:40sec,40个循环。
实验室前沿,了解实验室动态
2.3.2 仪器检测通道选择 内容来自实验室前沿网站
选择F1通道;在60℃时荧光信号收集方式设为“SINGLE”。 实验室前沿,了解实验室动态
结果判断:
本文来自实验室前沿
copyright sysqy.com
1. 检测样本中1E3copies /ml≤HBV DNA≤1E8copies /ml,测定结果有效,可直接报告相应的拷贝数;
2. 检测样本中HCMV DNA < 1E3copies/ml时,均报告为< 1E3copies/ml
内容来自实验室前沿网站
3. 检测样本中HCMV DNA = 0copies/ml时,报告为<最低检出限. 内容来自实验室前沿网站
sysqy.com
五、支持性文件 copyright sysqy.com
实验室前沿,了解实验室动态
《人巨细胞病毒核酸扩增荧光检测试剂盒操作说明书》