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荧光原位杂交技术(FISH)

时间:2009-07-30 10:45|来源:互联网| 分享|点击:


荧光原位杂交技术( fluorescence in situ Hybridization,FISH )是一种非放射性原位杂交方法,用特殊的荧光素标记 DNA 探针,在染色体、细胞或组织切片标本上进行 DNA 杂交,以检测细胞内 DNA 或 RNA 特定序列存在与否。近年来随着 FISH 所应用的探针种类的不断增多, FISH 技术不仅在细胞遗传学方面,而且还广泛应用于肿瘤的诊断、基因定位等。原有的放射性同位素原位杂交技术存在许多缺点,如每次检测需要重新进行标记,标记步骤繁琐,标记的探针不稳定,需要较长时间的曝光,并且对环境造成污染,在观察结果时,需要较多的细胞分裂相。此外,由于放射性银粒和染色体聚集在不同平面,可能引起计数上的误差。

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与之比较, FISH 则具有其不可比拟的优点:

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操作简便,一步式反应,能迅速得到结果,一次标记后可使用二年。 copyright sysqy.com

方法敏感,敏感程度等同甚至超过放射性同位素原位杂交。

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在同一标本上,可同时应用几种不同探针,标记不同的颜色。

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可用于分裂细胞和静止期细胞的染色体数量及基因改变的研究。 实验室前沿,了解实验室动态

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荧光原位杂交技术可以传统技术完美结合: FISH 和细胞免疫化学技术结合,可以同时用多种不同颜色标记不同的核苷酸链和蛋白质,这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点,转录和翻译的产物,有助了解核苷酸结构功能以及与蛋白质表达之间的关系。 FISH 技术和 RFLE ( RESTRICT FRAGMENT LENTH POLYMORPHSIM )结合,可以精确地描述染色体长,短臂等结构改变和染色体核型或复杂片段的性质。在基因图谱绘制中, FISH 和 Linkage mapping 结合起来即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地确定下来。

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显微镜及显微照相技术 本文来自实验室前沿

 

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荧光信号在高压汞灯的短波激发光下,常引起荧光信号发生淬灭,为防止淬灭的发生,需要将 DAPI 或 PI 稀释于 P - Phenlenediomine 的甘油缓冲液中。对于单拷贝探针的信号需要质量较好的荧光显微镜。如采用双色或多色滤光片可以同时观察 FITC 、 TEXAS - RED 等多种颜色的 FISH 信号。不论是染色体还是单拷贝基因的 FISH 信号均可用高度敏感和高分辨率的彩色胶片摄取,也可通过 CCD ( chargecoupled device )的照片系统或 LASER SCANNING IMAGING SYSTERM (激光扫描共焦成像系统)交摄取的信号储存在计算机内,经软件处理后,将信号叠加显示在荧光屏上。 本文来自实验室前沿

由于有多种方法标记 DNA 探针,帮一次杂交可以同时观察多个探针的信号,如两个不同的探针分别用 BIOTIN 和 DIGOXIGENIN 标记,杂交后用 AVIDIN - FITC 和抗- DIG - TEXAS - RED 分别与探针上的 BIOTIN 和 TEXAS - RED 信号。采用三种或三种以上不同的半抗原,如 BIOTIN 、 DIG 和 DNP 等标记探针,然后用多种不同颜色的荧光素,如 FITC (绿色), RHODAMINE (红色), CASCADE BLUE (兰色)等结合进行,可同时得到多种不同颜色的荧光信号。 内容来自实验室前沿网站

同上于常规的荧光显微镜的荧光显微镜的照像,彩色胶片不易多曝光,限制了这种联合标记探针的应用,使用 DIGITAL IMAGING CAMERA SYSTEM 或 CCD 照像系统,先分别多次摄取灰色的影像关储存在计算机内,而后冠以人为的颜色,运用软件系统融合各次得到的影像,最终形成一个复合的多颜色的图像。

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对已做过 G 显带的染色体片子,用 75 % 的乙醇或甲醇褪色后,可使 FISH 更清晰的辨认各条染色体及染色体结构异常(包括某些复杂的易位,插入,倒位等)。 FISH 和 G 显带技术结合,不仅可以用新近 G 带处理过的片子,而且还可用陈旧的 G 带片子。因些, FISH 技术可成功的帮助细胞遗传学家做回顾性分析。 内容来自实验室前沿网站

绿色荧光 FITC -激发光 495nm ,发射光 520nm 内容来自实验室前沿网站

红色荧光罗丹明( Rhodamine )-激发光 565nm ,发射光 590nm 本文来自实验室前沿

为得到最优的观察结果采用特异性单光谱带或三光谱带滤光片 实验室前沿,了解实验室动态

Tags:技术,荧光,FISH,标记,探针,信号,
责任编辑:何辉

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