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PCR设置内参照的定量方法

时间:2012-02-18 01:18|来源:实验室前沿| | 分享|点击:


PCR可分析极微量的DNA,并可同时扩增多种序列,已应用于基因转录水平的研究。尽管PCR是一种较理想的核酸定量方法,但实验方案的选择对PCR定量的成功与否极为重要,因为PCR是一个指数过程,控制反应率的任一参数的微小变化都会显著影响产物的生成量,在这些参数被精确优化与控制后,也还可能出现不同反应管中的产物量的差异,而导致结果的偏差。0

本文来自织梦

    设置内参照是理想的定量方法,它使定量测定mRNA工作变得较为简单易行,这一类方法已较为广泛地应用,下面介绍两种常用的方法。
    是指合成cRNA内参照的定量PCR,其基本方法是首先构建一个内参模板的质粒,在它的T7启动子下游依次排列有若干个不同的靶mRNA的5端引物序列,接下来排列有相对应的若干个3端引物序列及PolyA序列。用T7聚合酶转录cRNA,利用其cRNA的PolyA经oligo(dT)纯化后测定含量,再与靶基因的总RNA一起进行逆转录,将两者的逆转录产物作为模板一起作PCR扩增,并用同位素末端标记。由于两者扩增产物条带大小不同,因此可在PAGE电泳凝胶中区分开来,将扩增条带回收后,分别测定其放射活性强度,然后对模板的浓度作图。因为内参照与特异的mRNA在同一体系中的共同扩增效率在PCR对数期内是相同的,因此,可用标准曲线对特异mRNA进行定量。现以质粒AW108cRNA为内参对照来确定Jurkat细胞诱导产生的IL-2 mRNA量为例。
【材料与试剂】
(1)RNA提取所需试剂与材料
(2)MMLV逆转录酶
(3)32P末端标记引物(IL-2引物序列见第九章,放射性标记见第四章相应内容)
(4)dNTP,Tag DNA聚合酶等
【操作方法】
(1)以标准方法从细胞株中分离总RNA;以适当的转录系统合成AW108cRNA, cRNA产物经oligo(dT)柱纯化,测其260nmOD值,并计算含量;
(2) 用10μl逆转录反应系统,加入1μg细胞总RNA,1.77×102~1.77×107个分子的AW108 RNA,1×PCR缓冲液,1mmol/L DTT,0.5mmol/L 4种dNTP,10U RNA酶抑制剂,0.1μg 0ligo(dT)引物,1μl MMLV逆转录酶。于37℃保温60min,95℃加热5min 使酶失活,并立即置冰浴冷却;
(3) 将逆转录产物稀释3倍,混匀,加入50μmol/L的4种dNTP,上游和下游两种引物各5pmol/L,1×106cpm 32P末端标记引物,1U Taq DNA聚合酶,反应总体积为50μl,加50μl石蜡油,共进行25个循环,95℃×30s,95℃~55℃斜坡,2min,55℃30s,55℃~72℃斜坡,30s,72℃×10min。
(4) 取PCR产物5~10μl于10% PAGE胶中进行电泳分析,缓冲液为TBE。用EB染色,然后照相,切取合适的条带,用液闪计数仪测定放射强度。
  (5) 定量从凝胶中回收的扩增片段,用放射性对模板浓度作图,用标准曲线来定量特异mRNA。
Tags:定量,方法,参照,内,设置,PCR,
责任编辑:何辉

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