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疯牛病发光免疫检测方法

时间:2011-02-21 01:36|来源:实验室前沿| | 分享|点击:


Prionics-CheckLIA(1uminescence immunoassay)是Prionics AG公司在Prionics-CheckWestern的基础上开发出来的一种新的疯牛病诊断方法,即发光免疫试验。该方法是世界上第二代BSE诊断技术中的最快速的检测方法,也是第一个完全适合于自动化的方法,1999年通过欧盟认证。Prionics~-CheckLIA方法可以让实验室在短期内以少量人员的投入而完成高通量的工作,即特别适用于每天检测数百个样品的实验室。另外,自溶的脑组织也可以用本方法来检测,并且完全的自动化可以减少操作中的失误和感染BSE的风险。 织梦内容管理系统

 
    本方法的原理是将PK酶消化处理过的脑匀浆与酶标PrP单抗孵育,反应结合物转移到包被有另一种PrP单抗的捕获板内,然后加入发光底物并读数判定结果。整个反应时间约需4.5h,特异性和敏感性均为100%。
 
    疯牛病发光免疫测定方法的主要步骤如下。
 
    (1)采样  将牛头从牛体上取下来以后,用小剪刀尽量往里剪开枕骨大孔延髓部的脑膜,然后用一个手指(带两层手套)把延髓部脑组织与头部相连的神经和血管弄断。一切准备好后将采样勺从枕骨大孔处紧贴颅壁(避免损伤脑组织)伸入颅内,大约伸入10cm深左右停止,紧贴颅壁转动采样勺,转一圈后将采样勺转到与地面平行时用力往下或往上撬,同时往外抠,延髓部脑组织便会掉出颅腔。当然,也可以采用与免疫组织化学方法相同的采样方式,不过检测部位首选为脑闩部。
 
    (2)样品制备  称取0.5g脑闩组织放入匀浆管,加入10倍于(即5mi)该组织的匀浆工作液,用超声波或其他匀浆仪器制备成脑组织悬液。之后取出lml脑匀浆液转移到检测板(深孔板)。  
 
    (3)PK酶消化  从检测板每孔中各取出100/~L脑匀浆液加入到白色的消化板中,然后分别在每孔中加入50rtlPK酶消化液,混匀,用密封膜密封,47~C孵育60min。消化完后,每孔中加入10t~L消化阻止液,并混匀。
 
    (4)孵育  在预孵板(蓝色)的前两道加入30~tL配好的标准对照样品(强阳性、弱阳性和阴性),然后在其他孔中每孔加入15~tL检测缓冲液,再加入15ltl消化过的样品,混匀。在每孔中加入10,aL预孵缓冲液,室温下孵育2min。之后,在每孔中加入200uL稀释好的检测抗体,用密封膜密封,室温下孵育60rain,并以500r/min不断摇动。
 
     (5)捕获、从预孵板中每孔取出200rtl样品加入到捕获板(黑色),用密封膜密封,室温下孵育90min,并·以500r/rain不断摇动。
 
    (6)检测  用洗板缓冲液洗板,洗完后在每孔中加入100aL发光底物工作液,孵育5min,然后用MPL2读板。
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责任编辑:何辉

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