实验室前沿——做中国最专业实验室前沿资讯网

现在的位置:主页 > 实验技术 > 医学实验室 > PCR室 >

基因芯片实验操作流程

时间:2011-10-04 01:42|来源:实验室前沿| | 分享|点击:


1.样本DNA或RNA制备

    芯片实验中核酸的抽提没有特殊之处,参照常规的分子生物学实验手册就可以。但对于RNA样本,由于RNA的稳定性很差,在活体内的半衰期也很短,因此取材一定要新鲜,取材后迅速保存在液氮中,在整个处理过程中要非常小心,以免降解,影响实验成功率或结果的可靠性。
    2.核酸标记方式
    分子生物学常用的标记方法有同位素标记和非同位素标记方法,常用的同位素有33P、32P、125I及3H等化学发光标记和荧光标记,非同位素标记方法又分为化学发光法和荧光法。常用的化学发光物质有碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶,它们能催化相应的底物产生有颜色的沉淀物;生物素和地高辛是最常用的非同位素标记物。很多荧光染料、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶可直接同抗地高辛抗体及亲和素偶联。而目前常用的荧光染料种类有德克萨斯红(Texasred)、荧光系、罗丹明、Cy3、Cy5等。生物芯片中的标记方法普遍采用荧光方法,很少采用化学发光法和同位素标记方法。
核酸样本通常采用酶反应法进行标记,蛋白质样本采用化学方法或抗体—抗原间接标记的方式。核酸中常用的酶反应方法有:反转录法、随机引物法、切口平移(nicktranslation)、PCR、体外转录等。在酶反应过程中掺人带荧光的dNTP,从而标记新合成的核酸分子。如果酶反应中需要引物,如PCR、随机引物法和反转录法,也可以将荧光基团通过化学反应加到引物的末端。
    3.样品标记方法   
    样本标记方法很多,这里仅举几种常用的方法。
   (1)RNA标记方法:对于表达谱基因芯片和RNA不同剪切体的研究,是针对RNA样本进行标记。最常见的标记方式是用Cy3或Cy5荧光,通过反转录标记法,选择不同激发波长的荧光标记不同的样本。如Cy3或Cy5标记的dNTP,通过酶反应掺人到待测样品中,便可以在一张片子上同时检测两份标本的信息,做到平行性比较,数据更可靠。另外,由于反转录法所需RNA样本量大,一般需要20fig的总RNA。对于微量的组织样本很难制备足够的RNA,这时可以采用RNA线性扩增方法,最普遍采用的RNA扩增方法是RNA体外线性扩增方法。
    (2)DNA样本的标记方法:当对样本进行CGH分析、SNP、分子分型或甲基化研究时,主要选用DNA作为样本。对于CGH,可以进行全基因组标记,通常采用随机引物标记方法。这种方法需要的DNA量大,一般在2pg以上的基因组DNA。虽然有人发明了全基因组DNA的线性扩增技术以减少对样本量的需求,但效果上都不很理想,很难真正做到全基因组及完全的线性扩增。对于SNP研究,可以采用类似CGH的标记方式进行全基因组标记。由于SNP检测的是DNA的“质”,而不像表达谱或CGH质检测核酸的“量”,因此不必要考虑标记时DNA的线性关系,可以采用其他的全基因组的扩增方法。但由于杂交条件的限制,一般难以做到真正意义上的高通量。因此,一般只是选择少数目的基因的少数SNP位点进行研究,可以采用多重PCR标记方法标记目的片段代替全基因组标记。甲基化研究有两种方案,一种采用SNP的检测原理,另一种类似CGH的方法。
Tags:流程,操作,实验,芯片,基因,标记,方法,RNA,样本,采用
责任编辑:何辉

最新更新

点击排行

更多阅读者

其他人正在阅读