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PCR检测副溶血性弧菌技术

时间:2010-09-24 01:59|来源:实验室前沿| | 分享|点击:


     近年来,随着微生物基因组学的发展,微生物基因检测迎来了新的机遇。2000年,Makino等已经完成V.p的基因组测序,V.p毒力基因及特异的基因序列得到进一步确定。根据V.p特异基因序列,设计引物,进行PCR检测,是现阶段检测V,p的最快速准确的方法。目前应用于检测V.p的PCR方法主要有任意引物PCR(abritrarilyprimedPCR,Ap-PCR)、针对任意引物PCR、多重PCR(muhiplex-PCR)、实时PCR(Real-timePCR)。

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     1)任意引物PCR  Matsumoto等采用任意引物PCR对V.p进行检测。他们针对V。p的tdh基因和trh基因一段特异的序列,设计两条引物,
    引物1:5,--GGTGCGGGAA--3,,
    引物2:5,一GTTTCGCTCC一3,,
    对1977~1998年所收集的227株V.p进行PCR。通过电泳分析发现,1996-1998年收集的22株血清型为03:K6菌株与1996年以前收集的03:K6血清型菌株基因序列有所不同,为03;K6血清型新出现的变异株,并最初出现在孟加拉国。这是目前最简单的以基因为基础的细菌亚分型方法。
 
    (2)针对任意引物PCR  由于临床分离株绝大多数含有tdh基因,因此绝大部分研究者都根据tdh设计引物进行特异扩增。1993年,Lee等根据tdh基因设计引物,对36株TDH+株、89株TDH-株以及46株其他弧菌和肠道菌进行PCR检测。结果显示,36株TDH+株全部特异扩增出来,其余菌株都没有扩增;而检测灵敏度高,最低检测量可至40pgDNA,并可直接检测粪便标本,无需分离培养,方便快速。1999年,Kim等选择toxR基因序列设计两对引物,
    5’--GTCTTCTGACGCAATCGTTG--3和  5’一ATACGAGTGGTTGCTGTCATG一3’,
    对14株V.p、14株其他弧菌进行PCR。结果显示,14株V.p都得到一条368bp的特异扩增亮带,而其他菌株没有特异扩增。此外,Venkateswaran等选择gyrB基因设计引物对V·p进行PCR、Cordova等选择pR72H基因设计引物进行PCR,特异性、灵敏度都很好。
 
    (3)多重PCR  由于不是全部副溶血性弧菌都含;tdh基因或,trh。基因,所以只针对tdh或trh的单一PCR,有时会漏检。多重PCR(multiplex-PCR)能全方位高效率地检测Vpo1994年,Bej白等针对“、tdh、trh设计不同的引物对,在同一PCR反应体系内同时扩增tl、tdh、trh。结果显示,所有的V。p都扩增出“基因,tl基因是V.p特异的;54%的V.p扩增出tdh基因;只有38.73%的V.p扩增出trh基因;该法灵敏度高,能把log牡蛎培养肉汤里10~100个V.p检测出来。与其他常规生化方法相比,多重PCR更快速,仅8h就能完成检测,结果更为准确、可靠,而且还可改进成定量竞争PCR,对标本中靶序列进行定量。
 
    (4)实时PCR  常规PCR检测,需要从反应体系中吸取产物做电泳或Southern杂交等试验进行鉴定,转移过程中易污染,造成假阳性,而且耗费时间。1996年,Tyagi开创了一种实时PCR(Real-timePCP,)。实时PCR是在,PCR反应体系中加入标记有报告基团和淬灭基团的线性Taqman.探针或茎环型荧光分子信标探针,在墓因扩增过程中,与产物杂交,此时,报告基团和淬灭基团分开,根据能量共振转移现象,报告基团发出荧光而被检测。这种方法操作简单,闭管检测,减少污染,灵敏度高,并且可以在PCR结束或PCR过程进行同步定性或定量检测,面且可以进行临床大规模快速检测。
 
    2003年,Blackstone等针对tdh设计荧光分子信标探针,对从牡蛎中富集的13个不同种类的菌株进行实时PCR检测。结果显示,只有含tdh的V.p才被检测出来,特异性好,灵敏度高,能把每个纯培养体系的1个CFU检测出来。实时PCR检测快速准确,但需要价格昂贵的荧光检测仪和荧光分子标记探针,一般的实验室不能广泛开展。分子信标实时PCR技术自1996年开创以来短短几年就得到蓬勃的发展,相信随着经济的发展、技术的进步、实时荧光检测仪的昔及,将会得到更为广泛的应用。
Tags:技术,检测,PCR,基因,
责任编辑:何辉

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