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单克隆抗体特性的鉴定(2)

时间:2009-12-09 04:14|来源:实验室前沿| 分享|点击:


b、加热溶化1%琼脂糖凝胶,铺制琼脂糖板,每片约3ml。

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c、待琼脂凝固后,用打孔器在琼脂板上打出梅花形的小孔(中央1孔,周围6孔),然后封底。 实验室前沿,了解实验室动态

d、向中央孔加入抗小鼠IgG类或亚类抗血清,周围孔加入待检样品;加样后将琼脂板放入湿盒,置37℃水浴箱中12-24小时或4℃过夜,观察结果。 内容来自实验室前沿网站

(B)ELISA法

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该法不需要将样品浓缩,而且比免疫扩散法更快地得到结果。

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材料:

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a、ELISA所需用溶液同杂交瘤细胞的筛选一节。 本文来自实验室前沿

b、酶标板。

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c、山羊抗鼠Ig;兔抗小鼠Ig类及亚类特异性血清;HRP结合的山羊抗兔Ig等。 内容来自实验室前沿网站

d、待检杂交瘤细胞培养上清;阴性、阳性对照样品。

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方法一

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a、每孔加入适量的100ul山羊抗小鼠Ig,室温2小时;洗涤液洗2次。

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b、每孔加200ul封闭液,室温作用1小时。

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c、洗涤液洗2次;加100ul杂交瘤细胞培养上清,4℃过夜;设阴性、阳性对照孔。 本文来自实验室前沿

d、洗涤4次,每孔加100ul兔抗小鼠Ig类及亚类特异性抗血清,室温2小时。

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e、洗涤4次,加100ul HRP标记的山羊抗兔Ig;室温作用2小时。 实验室前沿,了解实验室动态

f、洗涤后,加底物显色,判读结果。

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g、若有HRP标记的抗小鼠Ig类及亚类试剂,则可省去e。

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方法二 实验室前沿,了解实验室动态

a、以适宜浓度的抗原包被酶标板,100ul/孔,4℃过夜。

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b、洗涤后,加入待检的单抗样品,100ul/孔,37℃1小时;设阴性、阳性对照孔。

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c、洗涤后,加入HRP标记的抗小鼠类及亚类Ig的抗体试剂,100ul/孔,37℃避光显色15分钟;用2mol/L H2SO4终止反应后,阅读各孔的OD490值。

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C、单抗纯度的鉴定 实验室前沿,了解实验室动态

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳(IEF)及免疫转印分析(WB)等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB的原理和方法请参阅有关专著,这里不再赘述。 sysqy.com

(2)单抗理化特性的鉴定 内容来自实验室前沿网站

从实用意义上说,单抗对温度和PH变化的敏感性以及单抗的亲合力都是理化特性鉴定的主要项目,它们可为单抗的使用和保存提供重要依据。其中单抗亲合力测定比较复杂,下面作简要介绍。

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抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的程度,其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇(部)和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数(K)表示。

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单抗亲合力测定是十分重要的,它可为正确选择不同用途的单抗提供依据。在建立各种检测方法时,应选用高亲合力的单抗,以提高敏感性和特异性,并可节省试剂。而在亲和层析时,应选用亲合力适中的单抗作为免疫吸附剂,因为亲合力过低不易吸附,亲合力过高不易洗脱。 copyright sysqy.com

精确测定单抗的亲合力是较困难的,好在实际应用中选择单抗时,通常只需测定各单抗的相对亲合力及其高低排列次序。常用的方法有竞争ELISA、非竞争性ELISA       、间接ELISA、间接法夹心ELISA等,这里仅介绍竞争性ELISA测定单抗亲和常数的方法。其步骤是: 实验室前沿,了解实验室动态

取适宜浓度的纯化抗原包被酶标板,100ul/孔,4℃过夜。洗涤后,加入封闭液(0.5% BSA-PBS,PH7.2)100ul/孔,37℃ 1小时。取一定浓度的单抗,与系列倍比稀释的抗原混合,4℃过夜,使反应达到平衡;必须注意所用抗原浓度至少要比抗体浓度高10倍以上。将平衡后的抗原抗体复合物加入酶标板孔中,100ul/孔,37℃ 1小时。洗涤后,加入适宜稀释度的HRP标记抗小鼠IgG抗体,100ul/孔,37℃ 1小时。洗涤后,加入底物(OPD)溶液,100ul/孔,37℃显色15分钟;2mol/L H2SO4终止反应后,于495nm波长测定各孔的吸收率(A)。按下列公式计算各单抗的亲和常数(K): sysqy.com

A0/(A0-A)=1+K/a0 sysqy.com

其中A0=无抗原时A值;A=采用不同浓度抗原时的A值;a0=抗原总量;K=亲和常数。

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(3)单抗与相应抗原的反应性测定 本文来自实验室前沿

单抗与相应抗原的反应性决定于它所识别的抗原表位,确定单抗针对的表位在抗原结构上的位置,是单抗特性鉴定的关键环节,同时,进一步分析这类表位的差异,可正确评价单抗的特异性和交叉反应性,如一些抗原为同属不同血清型共有,甚至是科内不同属所共有,而另一些抗原表位则是某种血清型乃至某一菌株或毒株所特有。此外,单抗的反应性往往呈现一种或几种免疫试验特异性,这在建株时予以测定,有利于正确使用这些单抗。 实验室前沿,了解实验室动态

单抗反应性测定的方法很多,包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等,选择何种方法依据不同的单抗特性和试验目的而定,请参阅有关论著的详细论述。转载注明出处实验室前沿 本文来自实验室前沿

Tags:鉴定,特性,克隆,细胞,单抗,杂交,方法,抗原,加入,染色体
责任编辑:何辉

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